المعاهد الوطنية للصحة الزمالة زمالة Kirchstein predoctoral AI - 64128 (MPM) ، GM - 41514 (MDC) ، GM - 48071 (IP)

1) إزالة عظام الفخذ كلا من الماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص لقطع تشريح العضلات والعظام عظم الفخذ تعرض فوق وتحت المفاصل (الركبة والورك). فهم وسط عظم الفخذ مع ملاقط التشريح وقطع فوق وتحت مفاصل لمغادرة قدر من الكردوس سليمة قدر الإمكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما العضلات قبالة نظيفة قدر الإمكان باستخدام مقص تشريح الصغيرة. نقل عظم الفخذ في طبق من RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي تنفيذ كل الإجراءات في غطاء محرك السيارة من هذه النقطة ، وذلك باستخدام وسائل الاعلام فقط العقيمة ، والصكوك ، نصائح ماصة والأطباق الثقافة. </li></ol> 2) عقم العظام عظم الفخذ : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غطاء محرك السيارة ، ونقل العظام من RPMI إلى صحن الثقافة صغيرة مليئة الايثانول 70 ٪ على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لامتصاص العظام في الإيثانول لمدة 5 دقائق على الجليد. </li></ol> 3) جمع نخاع العظم تحت ظروف معقمة : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العظام إلى صحن صغير يحتوي على ثقافة العقيمة التي تمت تصفيتها ثقافة العاصمة الابتدائية وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع ملاقط معقمة ، عقد العظام أكثر من طبق تجاهل أو أنبوب ، والعقيمة مع مقص ، وقطع كل epiphesis (نهايات العظام) قبالة. وينبغي خفض فضح نخاع العظم الذي هو مشرق الحمراء في وسط العظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع حقنة معقمة (26-28 إبرة قياس) ، تمتص حوالي 100-200 مل من وسائل الاعلام العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد العظام مع ملاقط معقمة على طبق جديد من وسائل الإعلام معقمة وادخال الإبرة في جانب واحد من العظام. موقف رأس الإبرة بالقرب من الجزء العلوي من عظم وغسل العظام ببطء خارجا مع وسائل الإعلام العقيمة. إذا كنت في وسط العظم ، ينبغي أن الإبرة في الشريحة بسهولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نخاع العظم يغسل بها ، سواء في قطع صغيرة أو قطعة واحدة. وينبغي أن يتم مسح بها من العظام والى صحن من وسائل الإعلام العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذه الخطوة حسب الحاجة لغسل تماما في نخاع العظم خارج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما العظام نظيفة ، سيكون أبيض وشفافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذا الإجراء مع عظم الفخذ الأخرى. تجاهل كل عظم الفخذ مرة واحدة كانت نظيفة. </li></ol> 4) إعادة تعليق وتدور باستمرار خلايا نخاع العظم : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى أنبوب الصقر العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا نقي لا تزال سليمة ، بلطف جدا ماصة وسائل الاعلام صعودا وهبوطا في الطبق ، لتفريق نخاع الى تعليق خلية واحدة. قد يستغرق ذلك عدة دقائق ، وينبغي أن يتم ببطء لتجنب قتل الخلايا عن طريق القوة المحضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي كما تفعل أي خلايا أخرى الثدييات. </li></ol> 5) انحلال الخلايا : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أنبوب من أجهزة الطرد المركزي بعد الانتهاء من زيادة ونقصان وسائل الإعلام من أجل إيقاف (صب) في النفايات صغيرة (50 مل أنبوب الصقر) في غطاء محرك السيارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend بيليه بواسطة عبها بلطف الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المعقمة باستخدام الماء المصفى وDPBS 10X 10X أو برنامج تلفزيوني ، بإجراء تحلل الماء لإزالة خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) باستخدام وحدات التخزين التالية : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 900 مليلتر من الماء المعقم تصفيتها </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 مل أو DPBS 10X 10X PBS </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 مل من ثانية PBS 10X 50-10 بعد إضافة الماء. من المهم جدا القيام بذلك فورا حتى يتم lysed فقط كرات الدم الحمراء. انها فكرة جيدة ان يكون كل من ماصات المعبأة والجاهزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل -- 10 مل من العقيمة وسائل الإعلام الأساسية العاصمة. </li></ol> 6) عدد الخلايا : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في هود ، وخلط مل 6 إلى 11 من خلايا نخاع العظام التي تدور بلطف أنبوب مع انعكاس طفيف ، والميل 45 درجة (وليس وسائل الإعلام بحيث يلامس الجزء العلوي من الأنبوب) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 10 مل من وسائل الإعلام في أنبوب عقيمة لفرز الأصوات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة رسملة الخلايا وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. </li></ol> 7) الخلايا شجيري التصفيحات : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي مطلي الخلايا في كثافة 106/mL × 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلايا من أجهزة الطرد المركزي ، ووسائل الإعلام والخلايا صب اعادة تعليق في كمية مناسبة من وسائل الإعلام العاصمة الابتدائية للتصفيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان في أنسجة الثقافة الحاضنة. </li></ol> 8) رعاية الثقافة والنضج : دائما التحقق من الثقافات قبل إضافة المزيد من وسائل الإعلام أو في أي استخدام التجارب. فحص الصحة العامة للخلايا والبحث عن تلوث محتمل. اليوم 0 : الخلايا الجذعية مطلي. اليوم 3 : إزالة 75 ٪ من وسائل الإعلام والخلايا غير adherant الابتدائية وإضافة وسائل الإعلام مرة أخرى العاصمة. اليوم 6 : بعد التصفيحات الخلية الأولي : إعادة لوحة الخلايا باستخدام الإجراء التالي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام ، التي ينبغي أن تحتوي على بعض البلدان النامية غير adherant عند هذه النقطة ، ومكان معقم في 50 مل أنبوب الصقر ، وترك لوحات جدا رطبة قليلا (كنت لا تريد الخلايا الملتصقة لتجف) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 مم EDTA في برنامج تلفزيوني على كل صفيحة ، والسماح للجلوس لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد لوحة بزاوية 45 درجة وسائل الإعلام ماصة بلطف صعودا ونزولا على الجزء السفلي من لوحة لطرد بلطف غير adherant الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي EDTA / PBS تصبح أكثر سمكا يجري جمع الخلايا تشير من أسفللوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد عدة دقائق من ذلك ، يمكن نقل خليط الخلية في أنبوب 50 مل الصقر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور كل الخلايا بعد تنفيذ هذا الإجراء لكل لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة العد والخلايا في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 ^ 6 في المائة في وسائل الإعلام لوحة الثانوية في العاصمة الجديدة العقيمة أطباق ثقافة 10 سم. عودة إلى خلايا الأنسجة الثقافة الحاضنة. </li></ol> اليوم 11/10 البلدان النامية ناضجة جاهزة للتحفيز / مستضد التحميل. 9) شجيرى تحفيز الخلية : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام LPS (lipopolyscaccharide) في تركيبة مع الببتيد المطلوب للتنشيط وتحميل الببتيد. اعتمادا على مصدر من LPS ، قد تختلف الظروف التحفيز إعطاء أفضل النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، ينبغي أن يكون الأمثل للمبلغ المطلوب من الببتيد لعرضها العاصمة. كانت الظروف في تحفيز هذا البروتوكول 100 نانوغرام / مل و 100 LPS ميكروغرام / مل OVA (ovalbumin). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مستضد تحميل / لعلاج مع LPS 18-24 ساعة قبل الحصاد / الاستخدام. </li></ol> وقد أضيف بعد كل مرشح العقيمة : وسائل الإعلام خلية شجيري الرجاء مراجعة قسم مناقشة لاستعراض مختلف الظروف شجيري خلية ثقافة والنمط الظاهري للخلية الجذعية الناتجة عن ذلك. وقد صممت هذه الظروف لإنتاج ثقافة الخلايا الجذعية الناضجة التي يقطنها بسرعة تجفيف الغدد الليمفاوية ، 18-24 ساعة بعد الحقن تحت الجلد والمستضد الحالي بكفاءة. وقد أضيف عامل تصفية العقيمة بعد كل شيء : وسائل الإعلام الرئيسية DC <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 مل IMDM (إزالة 55-60 مل الحجم النهائي لل500mL) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 مل FBS الحرارة المعطل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 مل من 200 ملي L - GLN ، وتركيز النهائي من 2 مم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 وحدة دولية / مل من البنسلين و 100 ملغ / مل الستربتوميسين (5 مل من القلم وحدة دولية / مل 10000 و 10،000 سهم بكتيريا ملغ / مل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 B - UM البيانات (14.3 B - M البيانات الأوراق المالية ، وتمييع 1:100 في هود الكيميائية ، واستخدام المجاهدين 35 لكل 100 مل من وسائل الإعلام للتركيز micromolar 50) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20-30 نانوغرام / مل GM - CSF </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100-400 وحدة دولية / مل IL - 4 10 تقريبا -- 40 نانوغرام / مل </li></ul> * وسائل الإعلام لSecondaryDC نضوج 100 نانوغرام / مل TNF - ألفا (إضافة إلى وسائل الإعلام العاصمة الابتدائي) * ملاحظة : GM - CSF + IL - 4 ينبغي أن تنتج الخلايا الجذعية غير الناضجة. وسوف تستخدم جنرال موتورز + IL4 - CSF (400 وحدة دولية / UL) + TNF - ألفا (100 ميكروغرام / مل) إنشاء خلايا تشبه الخلايا الجذعية الناضجة الوحيدات مشتقة. ومن المعروف عن الخلايا الجذعية الناضجة لا يستغرق مستضد كما بكفاءة والخلايا الجذعية غير الناضجة والثقافات المحلية قد نشرت TNF - A من خلايا انسجة 4.

<ol>
	<li>Miller, M. J., Safrina, O., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+single+cell+dynamics+of+CD4++T+cell+activation+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes.">Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.</a> J Exp Med. 200, 847-856 (2004).</li><li>Henrickson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+sensing+of+antigen+dose+governs+interactive+behavior+with+dendritic+cells+and+sets+a+threshold+for+T+cell+activation.">T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation.</a> Nat Immunol. 9, 282-291 (2008).</li><li>Jefford, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+comparison+of+DCs+generated+in+vivo+with+Flt3+ligand+or+in+vitro+from+blood+monocytes:+differential+regulation+of+function+by+specific+classes+of+physiologic+stimuli.">Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli.</a> Blood. 102, 1753-1763 (2003).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).</li><li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+functions+of+IL-4+receptor+types+I+and+II+for+dendritic+cell+maturation+and+IL-12+production+and+their+dependency+on+GM-CSF.">Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF.</a> J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).</li><li>Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+development+of+murine+dendritic+cells+by+GM-CSF+versus+Flt3+ligand+has+implications+for+inflammation+and+trafficking.">Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking.</a> J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).</li><li>Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+dendritic+cells.">Isolation of dendritic cells.</a> Curr Protoc Immunol. 3, (2001).</li><li>Winzler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+stages+of+mouse+dendritic+cells+in+growth+factor-dependent+long-term+cultures.">Maturation stages of mouse dendritic cells in growth factor-dependent long-term cultures.</a> J Exp Med. 185, 317-328 (1997).</li><li>Koch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+alpha+maintains+the+viability+of+murine+epidermal+Langerhans+cells+in+culture,+but+in+contrast+to+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor,+without+inducing+their+functional+maturation.">Tumor necrosis factor alpha maintains the viability of murine epidermal Langerhans cells in culture, but in contrast to granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, without inducing their functional maturation.</a> J Exp Med. 171, 159-171 (1990).</li><li>Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+repertoire+scanning+is+promoted+by+dynamic+dendritic+cell+behavior+and+random+T+cell+motility+in+the+lymph+node.">T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).</li><li>Wei, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signals+in+CD4++T+cells+during+early+contacts+with+antigen-bearing+dendritic+cells+in+lymph+node.">Ca2+ signals in CD4+ T cells during early contacts with antigen-bearing dendritic cells in lymph node.</a> J Immunol. 179, 1586-1594 (2007).</li><li>Castellino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8++T+cells+to+sites+of+CD4++T+cell-dendritic+cell+interaction.">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440, 890-895 (2006).</li></ol>

الخلايا الجذعية هي الوسطاء الرئيسيين للاستجابة المناعية التكيفية والخلية مستضد الأكثر كفاءة تقديم تتسم حتى الآن. طرق الإنسان والثقافة الماوس الخلية الجذعية في الأدب تختلف في نوع من السيتوكينات استخدامها للتأثير على تطوير أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية. خصوصا ، وتستخدم GM - CSF ...

generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging

يمكن العثور على العديد من الطرق لتحضير الخلايا الجذعية في الفئران الأدب. هنا ، نقدم طريقة التي تنتج CD11c عالية أكبر من 85 ٪ في الخلايا الجذعية الثقافة التي يعيش في العقدة الليمفاوية تجفيف بعد الحقن تحت الجلد وهذا المستضد للخلايا T مستضد معين (انظر الفيديو). بالإضافة إلى ذلك ، ونحن نستخدم الآلات ايسن Incucyte لتعقب الخلايا الجذعية النضج ، حيث ، في يوم 10 ، مورفولوجيا الخلايا المستزرعة هي الحال في خلية الجذعية الناضجة و&lt;85 ٪ من الخلايا CD11chigh. كشفت دراسة العرض مستضد في الغدد الليمفاوية الطرفية بنسبة 2 الفوتون التصوير أن هناك ثلاث مراحل متميزة من الخلايا الجذعية والتفاعل خلية T 1 و 2. المرحلة الأولى تتكون من الاتصالات بين الخلايا وجيزة المسلسل مستضد تي متحركة محددة للغاية ويحمل مستضد الخلايا الجذعية 1 و 2. تتميز المرحلة الثانية من خلال اتصالات طويلة بين المستضد محددة الخلايا التائية والخلايا الجذعية تحمل المستضد 1 و 2. أخيرا ، تتميز المرحلة الثالثة من قبل خلايا تي من فصل الخلايا الجذعية ، واستعادة القدرة على الحركة وبداية لتقسيم 1 و 2. هذا مثال واحد من هذا النوع من التفاعلات محددة مستضد التي يمكن تحليلها من قبل اثنين من الفوتون التصوير من مستضد محملة الخلايا خلية الصبغة التي تحمل علامات تعقب شجيري.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging at JoVE.com

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

العرض مستضد في الأجهزة اللمفاوية الثانوية من قبل خلايا الجذعية هو أمر حاسم لبدء بوساطة الخلايا التائية الاستجابة المناعية التكيفية. نحن هنا لشرح ثقافة نخاع العظم الخلايا الجذعية المستمدة الفئران ، التنشيط ، ووضع العلامات لمدة 2 الفوتون التصوير.

جيل من نخاع عظام الفئران الخلايا الجذعية المشتقة للاستخدام في 2 الفوتون التصوير

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

generation-bone-marrow-derived-murine-dendritic-cells-for-use-2

Research

JoVE Journal

Biology

31.0K Views.  University of California, Irvine (UCI). العرض مستضد في الأجهزة اللمفاوية الثانوية من قبل خلايا الجذعية هو أمر حاسم لبدء بوساطة الخلايا التائية الاستجابة المناعية التكيفية. نحن هنا لشرح ثقافة نخاع العظم الخلايا الجذعية المستمدة الفئران ، التنشيط ، ووضع العلامات لمدة 2 الفوتون التصوير.

Video: Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the initiation of an immune response 1. Here, we present methods for adoptive transfer of labeled T cells, isolation of lymph nodes, and imaging motility of CD4+ T cells in the explanted lymph node as first described in 2002 2. Two-photon imaging of immune cells requires that the cells are fluorescently labeled, either by staining with a cell tracker dye or by expressing a fluorescent protein. We demonstrate the adoptive transfer procedure of injecting cells derived from donor mice into the tail vein of a recipient animal, where they home to lymphoid organs within approximately 15-30 min. We illustrate the isolation of a lymph node and describe methods to ensure proper mounting of the excised lymph node. Other considerations such as proper oxygenation of perfused media, temperature, and laser power are discussed. Finally, we present 3D video images of naive CD4+ T cells exhibiting steady state motility at 37&deg;C.

Two-photon imaging has uncovered lymphocyte motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and durring an immune response 1. Here, we demonstrate adoptive transfer of T cells, isolation of lymph nodes, and imaging motility of CD4+ T cells in the explanted lymph node.

تشريح و 2 الفوتون التصوير من العقد الليمفاوية الطرفية في الفئران

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the ...

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development. To follow the migration of individuals in a crowd of thymocytes , we generate neonatal chimeras where less than one percent of the thymocytes are derived from a donor that is transgenic for a ubiquitously express fluorescent protein. To generate these partial hematopoetic chimeras, neonatal recipients are injected with bone marrow between 3-7 days of age. After 4-6 weeks, the mouse is sacrificed and the thymus is carefully dissected and bissected preserving the architecture of the tissue that will be imaged. The thymus is glued onto a coverslip in preparation for ex vivo imaging by TPM. During imaging the thymus is kept in DMEM without phenol red that is perfused with 95% oxygen and 5% carbon dioxide and warmed to 37&deg;C. Using this approach, we can study the events required for the generation of a diverse T cell repertoire.

We present step-by-step instructions for the generation of neonatal chimeras as well as the dissection and preparation of the thymus for ex vivo imaging by 2-Photon Microscopy.

التصوير في الموقع من الغدة الصعترية ماوس باستخدام الميكروسكوب 2 فوتون

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is a powerful technique. Using in vivo 2-photon microscopy through a cranial window it is possible to image fluorescent dyes injected intravenously. This permits one to image the cortical vasculature and also to obtain measurements of blood flow. This technique was originally developed by David Kleinfeld and Winfried Denk. The method can be used to study blood flow dynamics during or after cerebral ischemia, in neurodegenerative disorders, in brain tumors, or in normal brain physiology. For example, it has been used to study how stroke causes shifts in blood flow direction and changes in red blood cell velocity or flux in and around the infarct. Here we demonstrate how to use 2-photon microscopy to image blood flow dynamics in the neocortex of living mice using fluorescent dyes injected into the tail vein.

Cortical blood flow dynamics can be studied in vivo by imaging fluorescent dextran dyes injected into the tail vein of rodents with 2-photon microscopy. This video shows how to image blood flow dynamics in neocortex of mice through a glass-covered cranial window preparation.

A - 2 لأسلوب التصوير فوتون من تدفق الدم في القشرة المخية الحديثة من خلال نافذة القحف

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

في فيفو 2 فوتون التصوير الكالسيوم في طبقة 2 / 3 من الفئران

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

ثقافة الخلايا الجذعية من الدم النخاعي السلائف نخاع العظم

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

صاروخ موجه من الخلايا المكونة للدم في نخاع العظام

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

ناقضة العظم اشتقاق من الفأر نخاع العظم

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

تعبير البروتينات الفلورية الانصهار في مورين الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم والضامة

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...