건강 Kirchstein 원정대 predoctoral 교제 AI - 64128 (MPM), GM - 41514 (MDC), GM - 48071 (IP)의 국립 연구소

1) 쥐 한마리에서 모두 대퇴골의 뼈를 제거 <ol><li> 근육 버려야하고 (무릎 및 고관절) 이상과 관절 아래의 대퇴골 뼈를 노출 해부 가위를 사용합니다. 해부의 족집게로 대퇴골의 중심을 파악하고 최대한 그대로 epiphysis의를 떠나 위의와 관절 아래 컷. </li><li> 작은 해부 가위를 사용하여 가능한 한 많은 근육으로 닦아. RPMI 한 접시에 몽둥이를 전송합니다. </li><li> 모든 절차는 무균 미디어, 악기, 피펫 팁 문화 요리를 사용하여,이 시점부터 후드에서 수행되어야합니다. </li></ol> 2) 대퇴골의 뼈를 소독 : <ol><li> 후드에서 RPMI에서 얼음에 70 % 에탄올로 가득 작은 문화 요리에 유골​​을 전송할 수 있습니다. </li><li> 뼈가 얼음에 5 분 에탄올에 담그다 수 있습니다. </li></ol> 3) 무균 조건 하에서 골수를 수집합니다 <ol><li> 무균 여과 기본 DC 문화 매체를 포함하는 작은 문화 요리에 유골​​을 전송합니다. </li><li> 멸균 핀셋으로 폐기 접 관을 통해 뼈를 보유하고 멸균 가위로 (뼈의 종료) 각 epiphesis 잘라. 절단은 뼈의 중앙에 밝은 빨간색으로 골수를 노출해야합니다. </li><li> 멸균 주사기 (26-28 게이지 바늘)으로 살균 미디어 100-200에 대해 ML을 빨아. </li><li> 무균 미디어 신선한 음식을 통해 멸균 핀셋으로 뼈를 잡고 뼈의 한쪽에 바늘을 삽입합니다. 뼈 상단의 바늘의 끝 위치를 천천히 멸균 미디어 뼈를 씻으십시오. 당신이 뼈의 중심에있다면, 바늘은 쉽게 슬라이드한다. </li><li> 골수는 작은 조각 또는 한 조각으로 역시 밖으로 씻는다. 그것은 뼈 및 살균 미디어의 그릇에 밖으로 플러시해야합니다. </li><li> 완전히 뼈의 골수를 씻어 필요에 따라이 단계를 반복합니다. </li><li> 뼈를 깨끗하게되면, 그것은 흰색과 반투명 것입니다. </li><li> 다른 대퇴골 뼈이 절차를 반복합니다. 깨끗하게되면 각각의 대퇴부 뼈를 폐기하십시오. </li></ol> 4) 다시 일시 중지 및 골수 세포를 스핀 다운 : <ol><li> 멸균 팰컨 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> 골수이 아직도 그대로있다면, 아주 부드럽게 단일 세포 현탁액으로 골수를 깨고, 접시에 미디어를 피펫 아래. 이것은 몇 분 정도 걸릴 수 있으며 깎아지른듯한 강제로 세포를 죽이는 않도록 천천히 이루어져야합니다. </li><li> 어떤 다른 포유 동물 세포처럼 세포 원심 분리기. </li></ol> 5) 셀 용해 : <ol><li> 회전이 완료 후 원심 분리기에서 튜브를 제거하고 후드에있는 작은 쓰레기 (50 ML 팔콘 튜브)로 미디어에서 (가만히 따르다)를 부어. </li><li> 부드럽게 튜브의 바닥을 flicking하여 Resuspend 펠릿. </li><li> 무균 여과 물 10X DPBS 또는 10X PBS를 사용하여 다음 볼륨을 사용하여 적혈구 (RBCs)를 제거하는 물 용해를 수행 : <ul><li> 900 ML 무균 여과 물 </li><li> 100 ML 10X DPBS 또는 10X PBS </li></ul></li><li> 물을 추가한 후 10X PBS 50-10초 100 ML을 추가합니다. 그것은 즉시만을 RBCs가 lysed 것을 이렇게 매우 중요합니다. 그것은 두 pipettes 준비 채워 가지고하는 것이 좋습니다. </li><li> 무균 DC 기본 미디어 10 ML - 5 ML을 추가합니다. </li></ol> 6) 셀 카운트 : <ol><li> 후드에서 부드럽게 약간 역전, 45도 기울기 (미디어 튜브의 상단을 접촉하지 않도록)와 튜브를 소용돌이 치는하여 골수 세포의 6-11 ML를 섞어 </li><li> 계산을위한 멸균 튜브에 미디어 10 ML를 제거합니다. </li><li> 다시 모자 세포 원심 다시. </li></ol> 7) 도금 돌기 세포 : <ol><li> 전지는 1 X 106/mL의 밀도에 도금해야합니다. </li><li> 도금에 대한 기본 DC 미디어의 해당 금액의 원심 분리기에서 세포, 가만히 따르다 미디어와 다시 중단 세포를 제거합니다. </li><li> 조직 문화의 인큐베이터에 놓습니다. </li></ol> 8) 문화 케어 및 성숙 : 항상 더 많은 미디어를 추가하거나 실험에 사용하기 전에 문화를 확인하십시오. 세포의 일반적인 건강을 확인하고 잠재적인 오염을 찾습니다. DAY 0 : 돌기 세포 도금. DAY 3 : 미디어 비 adherant 세포의 75 %를 제거하고 다시 기본 DC 미디어를 추가합니다. DAY 6 : 초기 셀 도금 후 다음 절차를 사용하여 다시 판 전지 : <ol><li> (당신은 자기편 세포가 건조하고 싶지 않아요) 매우 약간 서부 유럽 표준시 번호판을 떠나, 살균 50 ML 팔콘 튜브의 일부가 아닌 adherant이 시점에서 DC가, 장소를 포함한다 미디어를 제거 </li><li> 각 플레이트에 PBS 3 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가하고 5 분 앉아 수 있습니다. </li><li> 45도 각도에서 접시를 잡고 부드럽게 부드럽게 비 adherant 세포를 이동시키다하는 접시의 바닥에 대한 미디어를 피펫 아래. </li><li> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) / PBS는 두껍게 나타내는 세포의 바닥에서 수집되는 되야지판. </li><li> 이 몇 분 후에 세포 혼합물은 50 ML 팔콘 튜브로 전송하실 수 있습니다. </li><li> 각 플레이트에 대해이 절차를 수행한 후 모든 셀을 스핀. </li><li> 1 밀도에 카운트 및 플레이트 세포 X 10 ^ 새로운 살균 10cm 문화 요리 보조 DC 미디어 6 회 판. 조직 문화의 인큐베이터로 세포를 반환합니다. </li></ol> DAY 10-11 자극 / 항원 로딩 준비 성숙 DC가. 9) 돌기 세포 자극 : <ol><li> 활성화 및 펩티드 로딩을​​ 위해 원하는 펩타이드와 함께 LPS를 (lipopolyscaccharide)를 사용합니다. LPS의 소스에 따라 서로 다른 자극 조건은 더 나은 결과를 제공할 수 있습니다. 또한, DC 프레 젠 테이션을 위해 펩타이드의 원하는 금액을 최적화해야합니다. 이 프로토콜의 자극 조건은 10​​0 NG / ML LPS 100 UG / ML OVA (ovalbumin)되었습니다. </li><li> 로드 항원 / 사전 수확 18-24시간에 대한 LPS와 치료 / 사용합니다. </li></ol> 돌기 세포 미디어 : 모든 후 무균 필터가 추가되었습니다 다른 돌기 세포 배양 조건을 검토하고 그 결과 돌기 세포 표현형에 대한 토론 섹션을 참조하십시오. 이러한 문화 조건이 성숙 돌기 세포를 생산하도록 설계되는 급속 18~24시간 피하 주사하고 효율적으로 현재의 항원 후 배수 림프절에 집. 기본 DC 미디어 : 모든 후 무균 필터가 추가되었습니다 <ul><li> 500 ML IMDM (500mL 최종 볼륨 55-60 ML 제거) </li><li> 50 ML 열 inactivated FBS </li><li> 200 MM L - Gln, 2 mm의 최종 농도 5 ML </li><li> 100 IU / ML 페니실린과 100 MG / ML 스트렙토 마이신 (10,000 IU / ML 펜 및 만 MG / ML Strep 주식 5 ML) </li><li> 50 음 B - 나 (14.3 M B - 내 물건은 화학 후드에 1:100을 희석, 50 micromolar 집중력 100 ML 미디어 당 35 UL 사용) </li><li> 20-30 NG / ML GM - CSF </li><li> 100-400 IU / ML IL - 4 약 10-40 NG / ML </li></ul> 성숙의 *에 대한 SecondaryDC 미디어 100 NG / ML TNF - 알파 (기본 DC 미디어에 추가) * 참고 : GM - CSF + IL - 4는 어려서 돌기 세포를 생산한다. GM - CSF를 사용하여 + IL4 (400 IU / UL) + TNF - 알파 (100 UG / ML)은 성숙 단핵구 파생 돌기 세포 유사 세포를 생성합니다. 중년 여인 돌기 세포는 미숙 돌기 세포와 문화가 내생 TNF - stromal 세포에서 출시 4 수 있습니다 한한 효율적으로 항원을 차지하지 알려져 있습니다.

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	<li>Miller, M. J., Safrina, O., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+single+cell+dynamics+of+CD4++T+cell+activation+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes.">Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.</a> J Exp Med. 200, 847-856 (2004).</li><li>Henrickson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+sensing+of+antigen+dose+governs+interactive+behavior+with+dendritic+cells+and+sets+a+threshold+for+T+cell+activation.">T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation.</a> Nat Immunol. 9, 282-291 (2008).</li><li>Jefford, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+comparison+of+DCs+generated+in+vivo+with+Flt3+ligand+or+in+vitro+from+blood+monocytes:+differential+regulation+of+function+by+specific+classes+of+physiologic+stimuli.">Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli.</a> Blood. 102, 1753-1763 (2003).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).</li><li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+functions+of+IL-4+receptor+types+I+and+II+for+dendritic+cell+maturation+and+IL-12+production+and+their+dependency+on+GM-CSF.">Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF.</a> J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).</li><li>Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+development+of+murine+dendritic+cells+by+GM-CSF+versus+Flt3+ligand+has+implications+for+inflammation+and+trafficking.">Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking.</a> J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).</li><li>Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+dendritic+cells.">Isolation of dendritic cells.</a> Curr Protoc Immunol. 3, (2001).</li><li>Winzler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+stages+of+mouse+dendritic+cells+in+growth+factor-dependent+long-term+cultures.">Maturation stages of mouse dendritic cells in growth factor-dependent long-term cultures.</a> J Exp Med. 185, 317-328 (1997).</li><li>Koch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+alpha+maintains+the+viability+of+murine+epidermal+Langerhans+cells+in+culture,+but+in+contrast+to+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor,+without+inducing+their+functional+maturation.">Tumor necrosis factor alpha maintains the viability of murine epidermal Langerhans cells in culture, but in contrast to granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, without inducing their functional maturation.</a> J Exp Med. 171, 159-171 (1990).</li><li>Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+repertoire+scanning+is+promoted+by+dynamic+dendritic+cell+behavior+and+random+T+cell+motility+in+the+lymph+node.">T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).</li><li>Wei, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signals+in+CD4++T+cells+during+early+contacts+with+antigen-bearing+dendritic+cells+in+lymph+node.">Ca2+ signals in CD4+ T cells during early contacts with antigen-bearing dendritic cells in lymph node.</a> J Immunol. 179, 1586-1594 (2007).</li><li>Castellino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8++T+cells+to+sites+of+CD4++T+cell-dendritic+cell+interaction.">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440, 890-895 (2006).</li></ol>

돌기 세포는 적응 면역 반응과 날짜에 특징이 가장 효율적인 항원 제시 세포의 핵심 중재자입니다. 문학 인간 및 마우스의 돌기 세포 배양을위한 방법은 다른 돌기 세포 유형의 발전에 영향을 미치는 데 사용 크린 시토킨의 종류에 차이가 있습니다. 특히, GM - CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF - 알파와 IFN - 감마는 성숙 미숙, 염증 및 정상 상태 체외 3-7에서 돌기 세포를 파생 murine 골수와 같은 생산하는 다른 조합에 사...

generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging

murine 돌기 세포의 준비를 위해 여러 가지 방법이 문헌에서 찾을 수 있습니다. 여기, 우리는 문화에 이상 85% CD11c 높은 돌기 세포를 생산하는 방법을 제시 것을 피하 주입 및 항원 구체적인 T 세포 (동영상 참조) 현재 항원 후 배수 림프절의 고향. 또한, 우리는 일 10시 교양 세포의 형태가 성숙 돌기 세포와 세포의 &lt;85% CD11chigh 아르의 전형이며, 돌기 세포 성숙을 추적하기 위해 에센 악기에게 Incucyte을 사용합니다. 2 - 광자 이미징에 의해 주변 림프절에 항원 프레 젠 테이션의 연구는 돌기 세포와 T 세포 상호 작용 1, 2의 세 개의 서로 다른 단계가있다는 것을 밝혔다. 페이즈 I는 매우 운동성이있는 특정 항원 T 세포와 돌기 세포 1, 2를 들고 항원 사이의 간단한 시리얼 연락처로 구성되어 있습니다. 차 두 항원에 특정한 T 세포와 돌기 세포 1, 2 베어링 항원 사이에 장시간 접촉에 의해 표시됩니다. 마지막으로, 단계 III는 운동성을 회복하고 1, 2,을 분할하기 시작, 돌기 세포에서 분리 T 세포에 의해 특징입니다. 이것은 항원 -로드 셀 추적 염료 분류 돌기 세포의 2 광자 영상으로 분석할 수 항원 특정 상호 작용의 유형의 한 예입니다.

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Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

돌기 세포에 의해 이차 림프​​ 장기의 항원 프레 젠 테이션은 T 세포 적응 면역 반응을 중재의 개시를 위해 중요합니다. 여기서 우리는 골수의 문화 파생 murine 돌기 세포, 활성화 및 2 광자 이미징에 대한 라벨을 보여줍니다.

골수의 생성은 2 광자 영상에서 사용하기 위해 Murine 돌기 세포를 유래

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

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31.0K 조회수.  University of California, Irvine (UCI). 돌기 세포에 의해 이차 림프​​ 장기의 항원 프레 젠 테이션은 T 세포 적응 면역 반응을 중재의 개시를 위해 중요합니다. 여기서 우리는 골수의 문화 파생 murine 돌기 세포, 활성화 및 2 광자 이미징에 대한 라벨을 보여줍니다.