National Institutes of Health אחווה אחוות Kirchstein predoctoral AI-64128 (MPM), GM-41514 (MDC), GM-48071 (IP)

1) הסר את שתי עצמות הירך של העכבר one <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים לנתיחה כדי לחתוך שרירים לחשוף את עצם הירך מעל ומתחת המפרקים (הברך הירך). אחוז במרכז של עצם הירך עם פינצטה לנתיחה לחתוך מעל ומתחת המפרקים לעזוב כמה שיותר epiphysis ללא פגע ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את כמו שריר רבה ככל האפשר באמצעות מספריים קטנים לנתיחה. מעבירים את עצם הירך לתוך צלחת של RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הנהלים צריכים להתבצע בשכונה מנקודה זו ואילך, רק באמצעות התקשורת סטרילית, מכשירים, טיפים פיפטה ומנות תרבות. </li></ol> 2) לעקר עצמות עצם הירך: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב למכסה המנוע, העברת עצמות מן RPMI לצלחת התרבות קטן מלא אתנול 70% על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לספוג עצמות באתנול במשך 5 דקות על הקרח. </li></ol> 3) איסוף מוח העצם בתנאים סטריליים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עצמות לצלחת תרבות קטן המכיל סטרילי התקשורת סינון ראשוני DC תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם פינצטה סטרילי, להחזיק את העצם מעל צלחת להשליך או צינור, ואת במספריים סטריליות, לחתוך כל epiphesis (קצות העצם) לדרך. לחתוך צריך לחשוף את מח העצם שהוא אדום בהיר במרכז העצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מזרק סטרילי (26-28 מחט מד), להתחנף כ 100-200 מ&quot;ל של התקשורת סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את העצם עם פינצטה סטרילי מעל צלחת מתוקים של התקשורת סטרילי ולהכניס את המחט בצד אחד של העצם. מקם את קצה המחט ליד החלק העליון של עצם לאט לשטוף את העצם החוצה עם התקשורת סטרילית. אם אתה במרכז העצם, המחט צריכה להחליק בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מח העצם שוטף החוצה, לא חתיכות קטנות או מקשה אחת. זה צריך להיות סמוקות מתוך העצם לתוך כלי התקשורת סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה זו כנדרש לחלוטין לשטוף את מוח מתוך העצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר העצם הוא נקי, זה יהיה לבן שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על נוהל זה עם עצם הירך אחרים. מחק כל עצם הירך לאחר שהוא נקי. </li></ol> 4) Re-Spin ו להשעות את מוח העצם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים צינור בז סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מח עדיין לא נפגעו, בעדינות רבה פיפטה התקשורת מעלה ומטה בצלחת, כדי לשבור את מח לתוך ההשעיה תא בודד. זה עלול לקחת כמה דקות צריך להיעשות לאט, כדי למנוע הרג תאים על ידי כוח מוחלט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים כמו כל בתאי יונקים אחרים. </li></ol> 5) Cell תמוגה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את הצינור מתוך צנטריפוגה לאחר הספין נעשה ויוצקים את התקשורת (למזוג) לתוך פסולת קטן (50 מ&quot;ל צינור בז) בשכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ידי מצליף בעדינות את החלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במים מסוננים סטרילית DPBS 10x 10x או PBS, לבצע תמוגה מים כדי להסיר את כדוריות הדם האדומות (RBCs) באמצעות הכרכים הבאים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 900 מ&quot;ל מים מסוננים סטרילית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 מ&quot;ל או DPBS 10x 10x PBS </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 100 מ&quot;ל של 10x PBS 5-10 שניות לאחר הוספת המים. חשוב מאוד לעשות את זה מיד, כך שרק RBCs הם lysed. זה רעיון טוב שיש pipettes שניהם מלאים ומוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל - 10 מ&quot;ל של התקשורת DC סטרילי בסיסיים. </li></ol> 6) ספירת תאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב למכסה המנוע, לערבב 6-11 מ&quot;ל של תאים במח העצם על ידי בעדינות מתערבל הצינור עם היפוך קל, הטיה של 45 מעלות (לא כל כך שהתקשורת נוגע בחלק העליון של הצינור) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של 10 מ&quot;ל של מדיה לתוך צינור סטרילי עבור לספור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-מכסה את התאים צנטריפוגות שוב. </li></ol> 7) תאים דנדריטים ציפוי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים צריכים להיות מצופה בצפיפות של 1 x 106/mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים בצנטריפוגה, מדיה למזוג מחדש תאים להשעות את הסכום המתאים של ראשי מדיה DC עבור ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ברקמת התרבות בחממה. </li></ol> 8) טיפוח תרבות והתבגרות: תמיד לבדוק את התרבויות לפני הוספת התקשורת יותר או שימוש בניסויים כלשהו. בדוק את הבריאות הכללית של תאים לחפש זיהום פוטנציאליים. יום 0: תאים דנדריטים מצופה. יום 3: הסרת 75% של התקשורת ולא adherant תאים ולהוסיף ראשי חזרה מדיה DC. יום 6: לאחר ציפוי תא ראשוני: Re-צלחת התאים באמצעות ההליך הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה, אשר יכילו כמה אי - adherant DCs בנקודה זו, ומניחים צינור סטרילי בז 50 מ&quot;ל, עוזב צלחות מאוד רטוב מעט (אתה לא רוצה את התאים חסיד להתייבש) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 mM EDTA ב PBS על כל צלחת ולאפשר לשבת במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזיקו את הצלחת בזווית של 45 מעלות בעדינות פיפטה התקשורת מעלה ומטה כנגד בתחתית הצלחת בעדינות כדי לסלק אי - adherant תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EDTA / PBS צריך להיות תאים המעידים עבה נמצאים שנאספו בתחתיתצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כמה דקות של זה, תערובת תאים ניתן להעביר את הצינור 50 בז מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין כל התאים לאחר ביצוע הליך זה עבור כל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרוזן צלחת התאים בצפיפות של 1 x 10 ^ 6 לכל צלחת משני מדיה ב-DC החדש סטרילי 10 מנות תרבות ס&quot;מ. חזור תאים לרקמות תרבות חממה. </li></ol> יום 10-11 DCs בוגר מוכן להעמסה גירוי / אנטיגן. 9) גירוי תאים דנדריטים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש LPS (lipopolyscaccharide) בשילוב עם הפפטיד הרצוי עבור הפעלה וטעינה פפטיד. בהתאם המקור של LPS, תנאי גירוי שונים יכולים לתת תוצאות טובות יותר. בנוסף, כמות הרצויה של הפפטיד להצגה DC צריך להיות מותאם. התנאים גירוי בפרוטוקול זה היו 100 נ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו - 100 LPS UG / mL OVA (ovalbumin). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנטיגן טען / לטפל עם LPS עבור 18-24 שעות לפני הקציר / להשתמש. </li></ol> מדיה תאים דנדריטים: מסנן סטרילי אחרי הכל נוספה נא עיין בסעיף דיון לבדיקה של תנאים שונים התרבות תאים דנדריטים את הפנוטיפ הנובע תאים דנדריטים. תנאים אלה נועדו תרבות לייצר תאים דנדריטים בשלים כי במהירות הביתה ניקוז בלוטות הלימפה, 18-24 שעות לאחר ההזרקה תת עורית אנטיגן הנוכחית וביעילות. ראשי DC מדיה: מסנן סטרילי אחרי הכל נוספה <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 מ&quot;ל IMDM (להסיר 55-60 מ&quot;ל עבור נפח סופי 500ml) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 מ&quot;ל חום מומת FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מ&quot;ל של 200 מ&quot;מ L-Gln, הריכוז הסופי של 2 מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 IU / mL פניצילין ו 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין (5 מ&quot;ל של פן IU / mL 10,000 ו -10,000 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​מניות סטרפטוקוקוס) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 UM B-Me (14.3 M B-Me המניות, לדלל 1:100 במנדף כימי, להשתמש ul 35 לכל 100 מ&quot;ל מדיה ריכוז 50 מיקרו) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20-30 ng / mL GM-CSF </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100-400 IU / mL IL-4 בערך 10-40 ng / mL </li></ul> התקשורת SecondaryDC עבור * התבגרות 100 ng / mL TNF-אלפא (להוסיף ראשי מדיה DC) * הערה: GM-CSF + IL-4 צריך לייצר תאים דנדריטים בשלים. באמצעות GM-CSF + IL4 (400 IU / ul) + TNF-אלפא (100 UG / mL) ייצרו תאים הדומים לתאים בוגרים מונוציטים הדנדריטים נגזר. תאים דנדריטיים בוגרים ידועים לא לקחת את אנטיגן בצורה יעילה ככל תאים דנדריטים בשלים ותרבויות ייתכן אנדוגני TNF-שפורסם מתאי סטרומה 4.

<ol>
	<li>Miller, M. J., Safrina, O., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+single+cell+dynamics+of+CD4++T+cell+activation+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes.">Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.</a> J Exp Med. 200, 847-856 (2004).</li><li>Henrickson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+sensing+of+antigen+dose+governs+interactive+behavior+with+dendritic+cells+and+sets+a+threshold+for+T+cell+activation.">T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation.</a> Nat Immunol. 9, 282-291 (2008).</li><li>Jefford, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+comparison+of+DCs+generated+in+vivo+with+Flt3+ligand+or+in+vitro+from+blood+monocytes:+differential+regulation+of+function+by+specific+classes+of+physiologic+stimuli.">Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli.</a> Blood. 102, 1753-1763 (2003).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).</li><li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+functions+of+IL-4+receptor+types+I+and+II+for+dendritic+cell+maturation+and+IL-12+production+and+their+dependency+on+GM-CSF.">Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF.</a> J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).</li><li>Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+development+of+murine+dendritic+cells+by+GM-CSF+versus+Flt3+ligand+has+implications+for+inflammation+and+trafficking.">Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking.</a> J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).</li><li>Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+dendritic+cells.">Isolation of dendritic cells.</a> Curr Protoc Immunol. 3, (2001).</li><li>Winzler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+stages+of+mouse+dendritic+cells+in+growth+factor-dependent+long-term+cultures.">Maturation stages of mouse dendritic cells in growth factor-dependent long-term cultures.</a> J Exp Med. 185, 317-328 (1997).</li><li>Koch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+alpha+maintains+the+viability+of+murine+epidermal+Langerhans+cells+in+culture,+but+in+contrast+to+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor,+without+inducing+their+functional+maturation.">Tumor necrosis factor alpha maintains the viability of murine epidermal Langerhans cells in culture, but in contrast to granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, without inducing their functional maturation.</a> J Exp Med. 171, 159-171 (1990).</li><li>Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+repertoire+scanning+is+promoted+by+dynamic+dendritic+cell+behavior+and+random+T+cell+motility+in+the+lymph+node.">T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).</li><li>Wei, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signals+in+CD4++T+cells+during+early+contacts+with+antigen-bearing+dendritic+cells+in+lymph+node.">Ca2+ signals in CD4+ T cells during early contacts with antigen-bearing dendritic cells in lymph node.</a> J Immunol. 179, 1586-1594 (2007).</li><li>Castellino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8++T+cells+to+sites+of+CD4++T+cell-dendritic+cell+interaction.">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440, 890-895 (2006).</li></ol>

התאים הדנדריטים הם המתווכים העיקריים של התגובה החיסונית הסתגלות התא אנטיגן היעילה ביותר להציג מאופיינת עד כה. שיטות אדם העכבר תרבית תאים דנדריטים בספרות נבדלות בסוג של ציטוקינים להשתמש כדי להשפיע על התפתחות סוגים שונים של תאים דנדריטים. יש לציין, GM-CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF-alpha ו - IFN-gamma מש...

generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging

כמה שיטות להכנת תאים דנדריטים Murine ניתן למצוא בספרות. כאן, אנו מציגים שיטה המייצרת יותר מ 85% תאים דנדריטים CD11c גבוה תרבות הביתה הצומת לימפה ניקוז לאחר הזרקה תת עורית ו אנטיגן ספציפי לערמונית להציג לתאי T (ראה וידאו). בנוסף, אנו משתמשים מכשירים אסן Incucyte לעקוב אחר ההבשלה תאים דנדריטים, שם, ב 10 יום, את המורפולוגיה של תאים בתרבית אופייני של תא בוגר הדנדריטים &lt;85% של תאים CD11chigh. המחקר של המצגת אנטיגן בבלוטות הלימפה הפריפריה על ידי 2-פוטון הדמיה עולה כי ישנם שלושה שלבים ברורים של תאים דנדריטים ואינטראקציה תא T 1, 2. שלב I מורכב הקשר בין ניעתי סדרתי קצר מאוד ספציפי אנטיגן בתאי T אנטיגן נושאת תאים דנדריטים 1, 2. השלב השני מתאפיין מגעים ממושכים בין תא-T ו אנטיגן ספציפי אנטיגן נושאות תאים דנדריטים 1, 2. ולבסוף, בשלב השלישי מאופיין בתאי T ניתוק מן התאים הדנדריטים, החזרת תנועתיות ומתחיל לחלק 1, 2. זוהי דוגמה אחת לסוג של אנטיגן ספציפי לערמונית אינטראקציות כי ניתן לנתח על ידי הדמיה שני הפוטונים של אנטיגן טעון תא גשש צבען שכותרתו תאים דנדריטים.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging at JoVE.com

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

מצגת Antigen באיברים הלימפה משני על ידי התאים הדנדריטים הוא קריטי עבור ייזום של תא T בתיווך תגובה חיסונית אדפטיבית. כאן אנו מדגימים את התרבות של מוח העצם נגזר תאים דנדריטים Murine, הפעלה, וסימון עבור הדמיה 2-פוטון.

הדור של מח עצם נגזר תאים דנדריטים Murine לשימוש 2-פוטון הדמיה

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

generation-bone-marrow-derived-murine-dendritic-cells-for-use-2

Research

JoVE Journal

Biology

31.0K Views.  University of California, Irvine (UCI). מצגת Antigen באיברים הלימפה משני על ידי התאים הדנדריטים הוא קריטי עבור ייזום של תא T בתיווך תגובה חיסונית אדפטיבית. כאן אנו מדגימים את התרבות של מוח העצם נגזר תאים דנדריטים Murine, הפעלה, וסימון עבור הדמיה 2-פוטון.

Video: Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the initiation of an immune response 1. Here, we present methods for adoptive transfer of labeled T cells, isolation of lymph nodes, and imaging motility of CD4+ T cells in the explanted lymph node as first described in 2002 2. Two-photon imaging of immune cells requires that the cells are fluorescently labeled, either by staining with a cell tracker dye or by expressing a fluorescent protein. We demonstrate the adoptive transfer procedure of injecting cells derived from donor mice into the tail vein of a recipient animal, where they home to lymphoid organs within approximately 15-30 min. We illustrate the isolation of a lymph node and describe methods to ensure proper mounting of the excised lymph node. Other considerations such as proper oxygenation of perfused media, temperature, and laser power are discussed. Finally, we present 3D video images of naive CD4+ T cells exhibiting steady state motility at 37&deg;C.

Two-photon imaging has uncovered lymphocyte motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and durring an immune response 1. Here, we demonstrate adoptive transfer of T cells, isolation of lymph nodes, and imaging motility of CD4+ T cells in the explanted lymph node.

Dissection ו 2-Photon הדמיה של בלוטות לימפה הפריפריה עכברים

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the ...

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development. To follow the migration of individuals in a crowd of thymocytes , we generate neonatal chimeras where less than one percent of the thymocytes are derived from a donor that is transgenic for a ubiquitously express fluorescent protein. To generate these partial hematopoetic chimeras, neonatal recipients are injected with bone marrow between 3-7 days of age. After 4-6 weeks, the mouse is sacrificed and the thymus is carefully dissected and bissected preserving the architecture of the tissue that will be imaged. The thymus is glued onto a coverslip in preparation for ex vivo imaging by TPM. During imaging the thymus is kept in DMEM without phenol red that is perfused with 95% oxygen and 5% carbon dioxide and warmed to 37&deg;C. Using this approach, we can study the events required for the generation of a diverse T cell repertoire.

We present step-by-step instructions for the generation of neonatal chimeras as well as the dissection and preparation of the thymus for ex vivo imaging by 2-Photon Microscopy.

בתחום ההדמיה באתרו של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is a powerful technique. Using in vivo 2-photon microscopy through a cranial window it is possible to image fluorescent dyes injected intravenously. This permits one to image the cortical vasculature and also to obtain measurements of blood flow. This technique was originally developed by David Kleinfeld and Winfried Denk. The method can be used to study blood flow dynamics during or after cerebral ischemia, in neurodegenerative disorders, in brain tumors, or in normal brain physiology. For example, it has been used to study how stroke causes shifts in blood flow direction and changes in red blood cell velocity or flux in and around the infarct. Here we demonstrate how to use 2-photon microscopy to image blood flow dynamics in the neocortex of living mice using fluorescent dyes injected into the tail vein.

Cortical blood flow dynamics can be studied in vivo by imaging fluorescent dextran dyes injected into the tail vein of rodents with 2-photon microscopy. This video shows how to image blood flow dynamics in neocortex of mice through a glass-covered cranial window preparation.

שיטה הדמיה 2-פוטון של זרימת הדם הניאוקורטקס דרך חלון גולגולתי

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

In vivo 2-Photon סידן הדמיה ב Layer 2 / 3 של עכברים

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

התרבות של תאים דנדריטים מיאלואידית מ מבשרי מח עצם

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

ביות של תאים hematopoietic אל מח העצם

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

גזירה האוסטאוקלסטים מעכבר מח עצם

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

ביטוי של חלבונים פיוז'ן פלואורסצנט תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם מאתר ו מקרופאגים

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...