نود أن نعترف الروح التعاونية لجميع أفراد مختبر كالدويل. وقد تم دعم حركة البحث اضطرابات في المختبر من خلل التوتر باخمان شتراوس ومؤسسة باركنسون ، مؤسسة باركنسون المتحدة الأمريكية جمعية مرض باركنسون ، جمعية مرض باركنسون ولاية ألاباما ، وجيه مايكل فوكس مؤسسة للأبحاث مرض باركنسون ، والبحوث الجامعية

ألف البناء التعبير البلازميد مطلوبة البلازميدات اثنين : واحد للتعبير عن الأنسجة محددة من الجينات في المصالح ، والمرتبة الثانية من حيث اختيار علامة التحول (على الرغم من علامة البلازميد وعادة ما يتوفر من داخل الأوساط البحثية). التجريبية البلازميد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد المروج التي يعبر عنها في نوع النسيج / خلية من الاهتمام ، وفي هذه الحالة ، نقل DA (Pdat - 1) يستخدم المروج. تم إنشاء هذا التعبير البلازميد باعتبارها بوابة Invitrogen نظام متوافق مع ناقلات الوجهة (pDEST - DAT - 1) للسماح الإدراج في أي من الجين المصب مصلحة المروج عن طريق الاستنساخ تهجيني 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [كدنا] من الجينات ذات الاهتمام هو تضخيم PCR باستخدام بادئات التي تحتوي على تسلسل عبارة B ATT تهجيني. هو معاد لأول مرة [كدنا] تضخيم في ناقلات pDONR201 المانحة لإنشاء ناقلات دخول ثم تحولت إلى سلالة بكتيريا E. DH5α. بعد اختيار recombinants ناجحة وصغيرة من الحمض النووي الإعدادية العزلة ، هو معاد للناقلات دخول pDEST - DAT - 1 ناقلات المقصد لإنشاء التعبير البلازميد. تفاصيل حول الاستنساخ تهجيني تتوفر إما من دليل أو في عبارة Invitrogen كالدويل وآخرون 5. </li></ol> اختيار ماركر البلازميد علامة المعدلة وراثيا البلازميد يتكون من ناقلات مع المروج القيادة والتعبير عن بروتين فلوري في الأنسجة واضحة. في هذا الإجراء بصفة خاصة ، والمروج UNC - 54 محركات الكرز التعبير البروتين في العضلات جدار الجسم (Punc - 54 : الكرز). باء توليد ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عبر Microinjection إن الرب انظر المادة ذات الصلة : <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?ID=833">https://www.jove.com/index/details.stp؟ID=833</a> جيم الصلبان الوراثية لتحليل تنكس عصبي DA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزرع الديدان باستخدام الاجراءات القياسية 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان Pdat 10 - 1 : : α - SYN ؛ Pdat - 1 : : ذكور : GFP 1 و 2 على لوحة التزاوج مع 3-4 L4 المرحلة المخنثين المعدلة وراثيا (التعبير عن Pdat - 1 : : الجينات وPunc X - 54 : الكرز) . يجب أن يتم تنفيذ هذا بشكل فردي لكل واحد من ثلاثة خطوط منفصلة مستقرة بإنشائه. بعد يومين ، وإزالة الذكور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفقد الجيل F1 ؛ إذا كانت هناك ذرية من الذكور عدة ، تزاوج ناجحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنساخ من أصل 5 خنثى L4 الحيوانات من عبور كل الذي يحمل كلا من Pdat - 1 : : GFP الفلورسنت علامة (موروث من الأصل من الذكور) و54 - Punc : الكرز جدار الجسم الفلورسنت علامة العضلات (الموروثة من الأم خنثى). الحيوانات المستنسخة الحاجة إلى أن تكون في مرحلة L4 لضمان أن لا تزاوج الذكور حتى الآن مع الحيوانات الموجودة على اللوحة. تسمح لهم في تقرير المصير ، عبر وإنتاج ذرية F2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم استنساخ الحيوانات المنتجة F2 في الخطوة 3 من أصل. على وجه التحديد ، ونقل الحيوانات ~ 50-10 الذي يحمل كل من علامات الفلورسنت لوحات الفردية الخاصة بهم. شاشة الجيل F3 لوحات فيها 100 ٪ من الحيوانات في التعبير عن GFP DA الخلايا العصبية وبعض الحيوانات هي تعبير عن الكرز في خلايا الجسم في العضلات الجدار. وسوف تكون هذه الحيوانات متماثلة اللواقح بالنسبة للPdat - 1 : : α - SYN ؛ Pdat - 1 : : GFP الجينات بينما يحيل ستابلي والتحوير التي أنشئت حديثا (الجينات X). </li></ol> دال تحليل الخلية العصبية الدوبامينية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحة جديدة لكل من الخطوط الثلاثة تم إنشاؤها أعلاه ، وكذلك Pdat - 1 : : α - SYN ؛ Pdat - 1 : وحده GFP السلالة. يسمح لها أن تنمو إلى مرحلة البلوغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البالغين 30-40 المعدلة وراثيا من كل سطر على لوحة جديدة. السماح لهم لوضع الأجنة لمدة 4 ساعات عند 20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة البالغين. السماح للأجنة لتطوير لمدة 3-4 أيام عند 20 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة L4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار ~ 100 المعدلة وراثيا L4 الحيوانات إلى لوحة تحتوي على 0.04 ملغ / 5 مل ، الفلورية 2&#39; - deoxyuridine (FUDR). هذا النوكليوتيدات التنمية كتل التناظرية من الجيل القادم عن طريق تثبيط تركيب الحمض النووي ، وبالتالي منع النسل الساحقة من الحيوانات التجريبية 7. حماية لوحات FUDR من الضوء لأنها حساسة للضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسيتم تحليل الحيوانات الكبار في الأيام التالية مختلف زرع البويضة. ويتم تحديد الأيام الملائمة لتحليل تجريبيا. على سبيل المثال ، فقد عقدنا العزم أن 77 ٪ ، 87 ٪ و 90 ٪ من 1 Pdat : ​​α - SYN ؛ Pdat - 1 : : حيوانات GFP المعرض تحول الخلايا العصبية DA في أيام 6 و 7 و 10 تطور آخر ، على التوالي. لذلك ، إذا نتوقع أن التحوير الاهتمام قد تعزز تنكس عصبي ، وسوف نقوم بتحليل في يوم 6 و / أو 7. وبالمثل ، سيتم تحليل الجينات المحورة التي قد قمع تنكس عصبي في أيام 7 و 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 منصات جديدة تجعل agarose (خلافا لمنصات microinjection آغار ، وتستخدم هذه الطازجة وغير مسموح لتجف). المبينة الشرائح المجهر اللتين قطعة من الشريط عبرها ؛ الشريط بمثابة هل لمنصات سميكة مكافئ. وضع 1 / 3الشريحة بينهما على مقاعد البدلاء (متوضعة كانوا ثلاثة على علم). وضع قطرة من agarose المنصهر على الشريحة مركز ووضع بسرعة شريحة أخرى على رأس agarose ، وعبر عمودي على كافة الشرائح الثلاث. جعل منصات إضافية عديدة ، تاركة الشرائح اثنين معا حتى منصة جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل الخلايا العصبية دودة DA ، مكان هبوط 6 ميكرولتر من Levamisole 3 ملم (مخدر) على 22 × 30 مم زجاج الغطاء. اختيار الحيوانات البالغة 40 (10 اضافية تتجاوز 30 إلى أن سجل) في هذا التراجع ، ثم عكس الزجاج غطاء على وسادة agarose. كرر لكل من الخطوط الاخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل 30 حيوانات في كل سطر من وجود كل عصبون ADE CEP وباستخدام مجهر مركب مع epifluorescence مكعب والتصفية التي تسمح برؤية FITC أو GFP. نستخدم منح GFP HYQ فلتر المكعب (تكنولوجيا كروما). بيانات السجل على ورقة التسجيل المرفقة. وسوف الحيوانات البرية من نوع الاحتفاظ الكامل في جميع مضان GFP CEP (4) والخلايا العصبية ADE 2. وسجل الحيوانات الفردية العارضة فقدان الخلايا العصبية كما WT - DA غير أو &quot;التحول&quot;. وبالمثل ، يمكن سجل مدى انحطاط عن طريق عد الخلايا العصبية خسر في مجموع كل حيوان وكذلك السكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر أكثر من مرة التحليل 2 (30 حيوانات أكثر في كل سطر لكل محاكمة). وبلغ العدد الإجمالي للديدان واظهار البرية من نوع الخلايا العصبية DA من ثلاث جولات من التحليلات. يتم تنفيذ ذلك التحليل الإحصائي لالعصبية باستخدام والطالب اختبار t (ع &lt;0.05) مقارنة الديدان التحكم (Pdat - 1 : : α - SYN ؛ Pdat - 1 : : GFP) مع سلالات أن الجينات مرشح الإفراط في التعبير عنها في الخلايا العصبية DA . </li></ol>

<ol>
	<li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans.">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li><li>Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothesis-based+RNAi+screening+identifies+neuroprotective+genes+in+a+Parkinson&#x2019;s+disease+model.">Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson&#x2019;s disease model.</a> PNAS. 105, 728-733 (2008).</li><li>Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-synuclein+blocks+ER-golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson's+models.">alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li><li>Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -. C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+alpha-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis.">The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> PNAS. 105, 145-150 (2008).</li><li>Caldwell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Genomics:+A+Discovery-Based+Laboratory+Course.">Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course.</a> , (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+maintaining+large,+aging+populations+of+Caenorhabditis+elegans.">A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).</li></ol>

ضياع العمر التي تعتمد على الخلايا العصبية الدوبامين هي السمة المميزة السريري للمرض باركنسون وارتبط مع تراكم أو misfolding من بروتين يسمى ألفا synuclein. نحن هنا لشرح كيفية التسمية ، عن طريق التحوير الفلورسنت ، والخلايا العصبية الدوبامين من C. ايليجانس وتقليد تنكس عصبي ينظر في مرض با...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Ultrapure</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 20x30 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-548-5A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope Slides</td>
<td>Plain, 3x1"</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-549</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting with Fluorescence</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ645</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epifluorescent</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>Model E-800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filter Cube, GFP HYQ</td>
<td>Endow Bandpass</td>
<td>Chroma Technology</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

application of a c. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential parkinson's disease genes

تحسينات في تشخيص وعلاج مرض الشلل الرعاش (PD) تتوقف على معرفة العوامل التي تجعل قابلية السكان المعرضين للخطر. في عملية محاولة تحديد العوامل الوراثية المرتبطة PD الرواية ، وقد ولدت كثير من علماء الجينات قوائم المرشحين ، تعدد الأشكال ، والبروتينات التي تمثل تقدما هاما ، ولكن هذه لا تزال غير معروف يؤدي ميكانيكيا. ويهدف عملنا في اتجاه تضييق هذه القوائم بشكل كبير من خلال استغلال مزايا نظام الحيوان نموذج بسيط. في حين أن البشر لديهم المليارات من الخلايا العصبية ، والمجهرية الدودة ايليجانس انواع معينة و302 على وجه التحديد ، والتي تنتج سوى ثمانية الدوبامين (DA) في hemaphrodites. التعبير عن الجينات البشرية ترميز البروتين PD - المرتبطة بها ، synuclein ألفا ، في نتائج ايليجانس جيم الخلايا العصبية DA في الجرعات والتي تعتمد على سن تنكس عصبي. معربا عن الديدان البشرية ألفا synuclein في الخلايا العصبية هي DA إسوي والتعبير وحقوق الإنسان على حد سواء GFP ألفا synuclein تحت المروج نقل DA (Pdat - 1). وجود GFP بمثابة علامة تصور بسهولة ليلي DA تنكس عصبي في هذه الحيوانات. أثبتنا في البداية أنه يمكن انقاذ ألفا synuclein التي يسببها DA تنكس عصبي في هذه الحيوانات التي torsinA ، وهو بروتين مع النشاط كوصي الجزيئية 1. مزيد من مرشح PD - الجينات ذات الصلة التي تم تحديدها في المختبر على نطاق واسع عبر جهود الفحص رني باستخدام مقايسة misfolding ألفا synuclein ثم تم الإفراط في المعبر عنها في DA جيم ايليجانس الخلايا العصبية. توصلنا إلى أن خمسة من بين سبعة اختبار الجينات ممثلة جهري مرشح كبير من المشتريات لأنها أنقذت ألفا synuclein التي يسببها DA تنكس عصبي 2. بالإضافة إلى ذلك ، أجرى مختبر ليندكويست (هذه مسألة إن الرب) شاشات الخميرة حيث يستخدم ألفا synuclein تعتمد سمية بوصفها قراءات للجينات التي يمكن أن تعزز أو قمع السمسة. درسنا في وقت لاحق من الجينات المرشحة لدينا الخميرة في مقايسة ايليجانس جيم تنكس عصبي ألفا synuclein المحرض والتحقق من صحة بنجاح العديد من هذه الأهداف 3 و 4. منهجيتنا ينطوي على جيل من متجه جيم ايليجانس DA التعبير الخلايا العصبية الخاصة به استنساخ الجين cDNAs تهجيني من مرشح تحت سيطرة المروج Pdat - 1. ثم يتم microinjected هذه الديدان في البلازميدات (N2) من النوع البري ، جنبا إلى جنب مع علامة اختيار للتحول الناجح. ويتم الحصول على خطوط متعددة مستقرة وراثيا تنتج البروتين في الخلايا العصبية DA مرشح وعبروا بشكل مستقل ثم إلى سلالة ألفا synuclein التنكسية والمقررة لتنكس عصبي ، في الحيوان على حد سواء وعلى مستوى الخلايا العصبية الفردية ، على مدى الشيخوخة.

Watch this Scientific Journal Video about Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes at JoVE.com

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

هذا الفيديو يوضح كيفية استخدام جيم ايليجانس لتقييم الدوبامين العصبية تنكس عصبي كنموذج لمرض باركنسون. وعلاوة على ذلك ، تستخدم شاشات الجينية لتحديد العوامل التي تعزز إما انحطاط أو اعصاب.

تطبيق الفحص جيم ايليجانس الدوبامين العصبية للتحلل من التحقق من صحة جينات مرض باركنسون المحتملة

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

application-c-elegans-dopamine-neuron-degeneration-assay-for

Research

JoVE Journal

Biology

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

15.9K Views.  University of Alabama. هذا الفيديو يوضح كيفية استخدام جيم ايليجانس لتقييم الدوبامين العصبية تنكس عصبي كنموذج لمرض باركنسون. وعلاوة على ذلك ، تستخدم شاشات الجينية لتحديد العوامل التي تعزز إما انحطاط أو اعصاب.

Video: Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson&#039;s Disease

Ole Isacson gives a concise overview of Parkinsons's disease, its causes, therapeutic strategies, and advances in Parkinson's research.

Isacson أوله : تطوير علاجات جديدة لمرض باركنسون

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key symptoms, such as tremor, rigidity and bradikinesia, develop when about 3/4 of dopaminergic cells are lost in the substantia nigra, and fail to provide for the smooth, coordinated regulation of striatal motor circuits. Depression and hallucinations are common, and dementia eventually occurs in 20% of patients. At this time, there is no treatment to delay or stop the progression of PD. Rather, the medications currently available aim more towards the alleviation of these symptoms. New surgical strategies may reversibly switch on the functionally damaged circuits through the electrical stimulation of deep brain structures, but although deep brain stimulation is a major advance, it is not suitable for all patients. It remains therefore necessary to test new cell therapy approaches in preclinical models.
Selective neurotoxic disruption of dopaminergic pathways can be reproduced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) or MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tertahydropyridine) whereas depleting drugs and oxidative-damaging chemicals may also reproduce specific features of PD in rodents. Unlike MPTP, 6-OHDA lesions cause massive irreversible neuronal loss, and can be uni- or bilateral. The 6-OHDA lesion model is reliable, leads to robust motor deficits, and is the most widely used after 40 years of research in rats1. As interactions between grafted cells and host can now be studied more thoroughly in mice rather than in rats, the model has been transposed to mice2,3, where it has been recently characterized4.
In this video, we demonstrate how to lesion the left nigro-striatal pathway of anesthetized mice by slowly delivering 2.0 &mu;L of 6-OHDA through a stereotaxically inserted micro-syringe needle. The loss of dopaminergic input occurs within days, and the functional impairments can be monitored over post-operative weeks and months by rating animal rotations induced by dopaminergic agents5. Here, we show full-body contralateral rotations occurring 10 minutes after a single subcutaneous administration of apomorphine, measured one month after the lesion. Outcomes and drawbacks are discussed below.

Murine Model for Parkinson&#039;s Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson disease is caused by loss of dopaminergic innervation to the striatum, which can be experimentally induced by 6-OH-dopamine. We describe how to perform a stereotaxic lesion and to monitor apomorphine-induced rotational behavior in mice. This model is useful and reliable for testing new therapies for Parkinson disease.

فأري النموذجي لمرض باركنسون : من آفة الدوبامين 6 - OH إلى اختبار السلوكية

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

جيل المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق تحويل Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

لإنتاج C. ايليجانس الجينات المحورة عبر Recombineering مع galK إختيار ماركر

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics: الكشف عن التغيرات العددية والهيكلية في جميع الكروموسومات 24 الإنسان وقت واحد باستخدام رواية الفحص FISH OctoChrome

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

باستخدام الحمض النووي الريبي التي تتوسط استراتيجية التغذية التدخل للكشف عن الجينات المسؤولة عن تنظيم حجم الجسم في نيماتودا<em&gt; C. ايليجانس</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. ايليجانس الانجذاب الكيميائي الفحص

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

منهج في التثقيف الجنينية<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; خلايا

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

قياس آثار البكتيريا على<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; السلوك باستخدام مقايسة الاحتفاظ البيض

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...