الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار الشلل الناجم عن السباحة أو SWIP ، وهو مقايسة سلوكية لتقييم إشارات الدوبامين في C.elegans. SWIP يسمح بسرعة تحديد الجينات داخل أو ذات الصلة إلى المشبك الدوبامين. هذه الطريقة تسمح للتحقيق في الآثار التي تنتجها فائض من الدوبامين خارج الخلية التي تسببها على سبيل المثال من المخدرات أو الطفرات في نقل الدوبامين.
لضمان أن جميع الديدان التي تم اختبارها أثناء الفحص تسبح لنفس القدر من الوقت ، يجب نقل الحيوانات بسرعة إلى المحلل. ومن بين الاجراءات سيريشا كودومالا وسيرين سوسي. كلاهما يعملان في مختبري
لإعداد ثقافات بداية الدودة ، استخدم ملعقة معقمة لقطع قطع صغيرة من أجار من لوحة تحتوي على C.elegans التي تتغذى بشكل جيد ونقل قطع agar إلى لوحات NA22 E.coli الفردية. بعد احتضان اللوحات في 20 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام، يؤكد بصريا وجود البالغين gravid تحت مجهر ستيريو. للحصول على مجموعة متزامنة من الديدان ، وبخ الماء على لوحة كاملة من البالغين جرافيد.
دوامة بلطف لوحة لإزاحة الديدان واستخدام ماصة التخلص من لنقل الديدان في أنبوب مخروطي البوليسترين 15 ملليلتر. بعد سحب الديدان من لوحة ثانية في الأنبوب ، اجمع الديدان عن طريق الطرد المركزي لثلاثة يغسل في 15 ملليلتر من الماء المصفى في كل غسل. يجب أن تظهر المياه واضحة بعد الغسيل الماضي.
بعد الطرد المركزي الأخير، أضف خمسة ملليلترات من محلول هيدروكسيد الصوديوم الصوديوم المعد حديثاً إلى الديدان وخلطه بسرعة مع دوامة. احتضان الأنبوب على الروك، ووضع قطرة من حل دودة على شريحة المجهر الزجاجي والتحقق من تحلل دودة تحت منظار كل دقيقتين لمدة أربع إلى ثماني دقائق. عندما تم lysed حوالي 70٪ من الديدان وكان قد تم الإفراج عن البيض، على الفور وقف التحلل مع إضافة العازلة البيض.
ثم الطرد المركزي الأجنة والجثث دودة أربع مرات resuspending بيليه مع عازلة البيض الطازجة بين يغسل لإزالة أي التبييض المتبقية. بعد الغسيل الأخير، يجب أن تظهر الكريه بيضاء. Resuspend بيليه في خمسة ملليلتر من المياه autoclaved وخمسة ملليلتر من 60 ٪ سكروز لفصل الأجنة من الذبائح عن طريق الطرد المركزي.
إزالة الأنبوب بعناية من الطرد المركزي بعد فصل التدرج الكثافة واستخدام ماصة باستور الزجاج لنقل ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من الأجنة العائمة في الغضروف المفصلي العلوي في أنبوب مخروطي جديد 15 ملليلتر. اغسل الأجنة ثلاث مرات بالماء المُقلَد ذاتيًا لإزالة السكروز متبوعًا بثلاثة غسولات في المخزن المؤقت M9. بعد الغسيل الأخير ، احتضان الأجنة على شاكر بين عشية وضحاها في 10 ملليلتر من المخزن المؤقت M9 الطازج للسماح للبويضات بتفقس والبقاء في مرحلة يرقة L1.
بعد ما لا يزيد عن 14 ساعة على شاكر، وغسل اليرقات L1 ثلاث مرات مع الماء الأوتكفا لإزالة أي الفيرومونات الصادرة عن اليرقات وإعادة تعليق بيليه اليرقات في ملليلتر واحد من الماء. تمييع aliquot من الديدان إلى نسبة 1 إلى 10 وإضافة 1:10 ميكرولتر قطرة على شريحة زجاجية وعدد الديدان تحت المجهر ستيريو. كرر للحصول على متوسط عدد الديدان.
استخدام ماصة لإضافة ما يكفي من قطرات من حل دودة على درجة حرارة الغرفة NA22 لوحة لبذور ما يقرب من مرة واحدة 10 إلى الديدان الثالثة للثقافة وترك لوحة نصف مفتوحة حتى قطرات تجف. ثم احتضان لوحة مغطاة ومقلوب في 20 درجة مئوية لحوالي 44 إلى 48 ساعة أو حتى الديدان تصل إلى مرحلة L4 في وقت متأخر كما أكد بصريا تحت مجهر ستيريو. للتقييم اليدوي لـ SWIP، أضف 40 ميكرولترات من محلول التحكم مع أو بدون 0.5 ميلليمولور الأمفيتامين في لوحة بقعة زجاجية.
تحت منظار مجسم، واختيار ثمانية إلى 10 في وقت متأخر L4 الددان المرحلة مع اختيار رمش وغمر البيكد في البئر التي تحتوي على الحل حتى الديدان تتحرك قبالة اختيار والسباحة في الحل. بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت. لاحظ عدد الديدان التي تم إصدارها في البئر ولاحظ وسجل عدد الديدان التي تعرض SWIP في كل علامة دقيقة لمدة إجمالية 10 دقائق.
في نهاية الإجراء، انسخ البيانات الخام في جدول بيانات وحساب نسبة الديدان المشلولة بقسمة عدد الديدان المشلولة في كل دقيقة على العدد الإجمالي للدودة التي تم اختبارها في جميع أنحاء الفحص والضرب على 100. نسخ قيم النسبة المئوية في أي برنامج الرسم البياني و الإحصائية و رسم البيانات مع قيم النسبة المئوية SWIP على المحور ص والوقت على المحور س باستخدام تنسيق الرسم البياني س ص. ويمكن إجراء تحليل إحصائي بين المجموعات الخاضعة للمراقبة والمعالجة الأمفيتامينية ووقت العلاج، وذلك مثلا باستخدام التحليل في الاتجاهين والتحليل اللاحق.
للتحليل الآلي للشلل الناجم عن السباحة ، وإعداد الكاميرا ، وبرنامج تعقب دودة ، وسيناريو لتشغيل تحليل البرمجيات تتبع واستخدام اختيار رمش لوضع واحدة في وقت متأخر من مرحلة L4 دودة في لوحة الزجاج بقعة كما هو مبين في وقت سابق. ثم تسجيل أشرطة الفيديو السباحة من دودة واحدة في وقت واحد واستخدام برنامج تعقب دودة لحساب وتيرة الانحناءات الجسم، بعد السيناريو المقدمة مع برنامج تتبع للحصول على تردد الدودة سحق، وتوليد خرائط الحرارة من البيانات سحق دودة. معظم الديدان التي تم اختبارها في محلول التحكم تسبح باستمرار لمدة 10 دقائق على الأقل.
لا تظهر الديدان المعرضة للتحكم أو الأمفيتامين SWIP في الدقيقة الأولى من المراقبة. ومع ذلك ، في حين أن الديدان المعالجة بمحلول التحكم تستمر في السباحة لمدة 10 دقائق ، تبدأ الديدان المعالجة مع الأمفيتامين في عرض SWIP بعد دقيقتين من العلاج. وبعد 10 دقائق، 66٪ من الحيوانات تظهر SWIP.
وتوجد هنا أمثلة على خرائط الحرارة للحيوانات المعرضة للرقابة أو الأمفيتامين مع زيادة متوقعة كبيرة في الشلل الملاحظ في الحيوانات المعالجة با للامفيتامين. قبل محاولة هذا الفحص، ينبغي للمرء أن يكون على دراية جيدة مع قطف والتدريج التنموية من C.elegans. يجب تأكيد مشاركة النظام الدوبامين في سلوك SWIP باستخدام الحيوانات التي تفتقر إلى التعبير عن البروتينات الدوبامين أو عن طريق استنفاد من فديصلات الدوبامين مع ريسربين.
يمكن أن يكون SWIP مفيدة في تحديد البروتينات الجديدة المشاركة في آلية عمل الأدوية التي تعمل في المشبك الدوباميني.
