编制果蝇实时成像的胚胎使用悬滴协议

摘要

一个简单，廉价，​​有效的方法是准备住成像分析果蝇胚胎。我们的协议提供湿度和气体交换，不压缩的果蝇胚胎。这种方法适用于基于GFP的使用立体显微镜或直立复式显微镜的果蝇胚胎的实时成像。

摘要

绿荧光蛋白质（GFP）为基础的timelapse生活成像的动态进程，如组织形态发生，细胞与细胞间的粘附，或细胞死亡的基因调控研究的一个强大的技术。果蝇胚胎表达GFP很容易使用以立体或共聚焦显微镜成像。任何带电成像协议的目标是尽量减少不利影响，如脱水和缺氧。前准备活成像分析果蝇胚胎的协议涉及dechorionated胚胎放置在卤烃油和夹层之间的卤烃气体渗透膜和盖玻片

研究方案

制备

1. 收集胚胎标准的葡萄汁琼脂^平板 4 。它方便地使用一个自动化的果蝇卵收集器（Flymax科学器材有限公司）。使用同步上演胚胎集合将减少必须执行，以获得足够数量的胚胎在发育阶段所需的数量dechorionations。
2. 准备一个dechorionation幻灯片，附加了一块双面胶带载玻片;删除从磁带的支持。
3. 准备切割一块组织，以适应在香港总商会以及实时成像室。在精心组织和湿用蒸馏水。
4. 混合卤烃油（卤烃产品公司）粘度700系列和56系列在以1:1的比例。该混合物可以存储并无限期使用。
5. 盖玻片（22 × 40毫米，第2号）的表面上放置几小滴卤烃油。该卷是并不重要，但应在20-40μL为了。

程序

1. 随着立体显微镜的帮助下，收集胚胎使用一对珠宝商的镊子（第5号），或一个非常优良的油漆刷的葡萄汁琼脂板。胚胎往往坚持互相钳“提示;他们很容易聚集在团块。
2. 随着立体显微镜的帮助下，轻轻地放下，坚持到磁带表面上的dechorionation幻灯片钳提示胚胎团块。
3. 再次使用的体视显微镜，轻轻地微调或中风的一侧钳胚胎为了打破开放外糯绒毛膜不破裂的内在卵黄膜（如果卵黄膜破裂，胚胎破裂）。
4. 一旦外层的蛋壳已破裂，挑逗胚胎绒毛膜; dechorionated胚胎往往要坚持到表面的镊子。小心避免触摸磁带表面dechorionated胚胎。
5. 只要一个胚胎dechorionated，迅速转移到盖玻片先前准备的卤烃油下降。触摸账面dechorionated胚胎的卤烃油滴表面钳的一角 - 这个位置被驱逐出来的钳入油胚胎。
6. 确认胚胎转移到滴油。这是可以做到与你工作在一个黑色的背景，并使用光纤照明光源设置在一个斜角肉眼。
7. 试图dechorionate另一个胚胎之前，清洁镊子从任何石油。涂油钳绒毛膜表面上有较少的购买，使得dechorionation更加困难。
8. Dechorionated胚胎蓬勃的卤烃油。使用产钳或画笔，并通过立体显微镜下观察时，推胚胎油价下跌的底部，并安排在所需的位置。
9. 快速翻转盖玻片以及在实时成像室。确认胚胎所需方向对盖​​玻片休息。由于他们在油中的浮力，胚胎会浮动盖玻片表面。盖玻片固定用胶带实时成像室。通风孔，在该地区的磁带跨越盖玻片和实时成像室以及结束之间的差距在磁带削减室。
10. 一个正直的荧光显微镜或荧光体视显微镜，现在可以用于图像的胚胎。

讨论

我们描述了一种实时成像分析，我们称之为悬滴协议的准备果蝇胚胎的新方法。不幸的是，它是不可能的使用悬滴协议，如果倒置显微镜工作。在这种情况下，夹层技术（抽象以上所述），必须使用压缩的胚胎仍然令人担忧。

在细胞的形状和大小进行测量，以计算力量与形态运动相关的实验，使用一个堂堂正正的显微镜和悬滴协议是可取的，因为胚胎压缩减少。此外，减少?...

材料