Подготовка Drosophila Эмбрионы для Live-визуализации с использованием висячей капли протокола

Резюме

Простой, недорогой и эффективный способ получения эмбрионов дрозофилы для живого изображения анализ. Наш протокол обеспечивает влажность и газовый обмен и не сжимает эмбриона дрозофилы. Этот метод подходит для GFP основе живого изображения эмбрионов дрозофилы использованием стереомикроскопа или прямого микроскопа соединения.

Аннотация

Зеленый флуоресцентный белок (GFP)-основанной timelapse жить-визуализации является мощным средством для изучения генетической регуляции динамических процессов, таких как ткани морфогенеза, межклеточной адгезии, или гибель клеток. Дрозофилы эмбрионов выражения GFP легко отображаемого использованием либо стереоскопических или конфокальной микроскопии. Цель любого живого изображения протокол является сведение к минимуму негативных последствий, таких как обезвоживание и гипоксии. Предыдущие протоколы для подготовки дрозофилы эмбрионов для живого изображения анализа привлекли размещения dechorionated эмбрионов в галоидоуглеводородов нефти и сэндвич их между галоидоуглеводородов газа мембраны и покровное

протокол

Подготовка

1. Сбор эмбрионов на стандартных виноградного сока агаром ^4. Это удобно использовать автоматизированные дрозофилы Яйцо Collector (Flymax Научное оборудование Ltd.) Использование синхронных поставил эмбриона коллекции позволит сократить число dechorionations которые должны быть выполнены для получения достаточного количества зародышей на желаемый стадии развития.
2. Подготовка dechorionation слайд путем присоединения кусок двухсторонней ленты на предметное стекло микроскопа; удалить защитную пленку с ленты.
3. Подготовка жить камеры изображений за счет сокращения кусок ткани, чтобы вписаться в хорошо палаты. Место ткани хорошо и мокрый его с дистиллированной водой.
4. Смешайте галоидоуглеводородов нефти (хладон Продукты корпорации) вязкость серии 700 и серии 56 в соотношении 1:1. Смесь может храниться и использоваться на неопределенный срок.
5. Место несколько маленьких капель галоидоуглеводородов нефти на поверхности покровного (22 X 40 мм, № 2). Объем не является критической, но должно быть в порядке 20-40 мкл.

Процедура

1. С помощью стереомикроскопа, собирать эмбрионы из виноградного сока-агар пластин с использованием либо пару щипцов ювелирного (№ 5) или очень тонкой кистью. Эмбрионы, как правило, слипаются друг с другом и советы щипцов; они легко собраны в скопления.
2. С помощью стереомикроскопа, аккуратно опустите скопления эмбрионов, которые присоединились к кончикам щипцов на поверхность ленты на dechorionation слайда.
3. Снова используя стереомикроскопа, мягко подтолкнуть или инсульт эмбрионов с сторону щипцы для того, чтобы вскрыть внешнюю восковой хориона без разрушения внутренней мембране желточной (эмбрион лопнет, если желточной оболочки разрывается).
4. Как только внешний хориона был разорван, дразнить эмбриона от хориона; dechorionated эмбрион имеет тенденцию придерживаться поверхность щипцов. Заботьтесь, чтобы не прикасаться dechorionated эмбриона к поверхности ленты.
5. Как только эмбрион dechorionated, быстро перевести его на заранее подготовленные капли галоидоуглеводородов нефти на покровное. Сенсорный кончике пинцета проведения dechorionated эмбриона поверхность капли масла галоидоуглеводородов - это выбивает эмбриона от щипцов на нефть.
6. Подтверждение передачи эмбриона жировой капли. Это можно сделать невооруженным глазом, при условии, что вы работаете над черным фоном и использовать волоконно-оптический источник освещения набор под косым углом.
7. Перед тем, как dechorionate другого эмбриона, чистки нефти из щипцов. Пинцет покрытием на нефть имеют меньше покупки на хориона поверхности, что делает dechorionation сложнее.
8. Dechorionated эмбрионы плавучей в галоидоуглеводородов нефти. Использование щипцов или кисть и при просмотре через стереомикроскопа, нажмите эмбриона на дно падения нефти и расположить его в нужном положении.
9. Быстро инвертировать покровное над колодцем живой камеры изображений. Убедитесь, что эмбрионы упираясь покровное в требуемом направлении. Из-за их плавучесть в масле, эмбрионов теперь будет плавать на нижнюю поверхность покровного стекла. Fix покровное к камере жить изображений с ленты. Вентиляция камеры вырезка отверстий в ленте в районе, где лента охватывает промежуток между окончанием покровного и конца и живой камеры изображений.
10. Вертикальном флуоресцентного микроскопа или флуоресценции стереомикроскопа теперь может быть использована для изображения эмбрионов.

Обсуждение

Мы описываем новый метод подготовки дрозофилы эмбрионов для живого анализа изображений, которые мы называем висячей капли протокола. К сожалению, это не представляется возможным использовать висячей капли протокол, если работать с инвертированным микроскопом. В этом случае сэндвич т...

Материалы