无有机溶剂和醋酸，蛋白质与考马斯亮蓝G - 250凝胶染色

摘要

蛋白质与考马斯亮蓝（CBB）的G - 250在聚丙烯酰胺凝胶染色的一个短的协议是在古典与CBB染色程序，而无需使用有机溶剂或醋酸。

摘要

在古典蛋白染色用考马斯亮蓝（CBB）与有毒和易燃的有机溶剂（甲醇，乙醇或异丙醇）和乙酸含量高的解决方案的协议是用于固定，染色和脱色凝胶中的蛋白质经SDS - PAGE分析。为了加快程序，在很短的时间微波炉加热的染色溶液是常用的。这通常会导致有毒或有害的甲醇，乙醇或异丙醇和醋酸在实验室应避免由于安全方面的考虑的强烈气味的挥发。在最初两个EM Wondrak（US2001046709（A1），US6319720（B1））专利申请公布一个协议，染色液的另一种成分是其中不含有机溶剂或酸是用来描述。溶解在bidistilled水的CBB（CBB G - 250每公升60 - 80毫克）和35毫米盐酸是作为唯一的染色溶液中的其他化合物的补充。 CBB staning凝胶完成后bidistilled水凝胶的SDS - PAGE和彻底清洗。通过加热凝胶在洗涤和染色步骤，完成这个过程可以更快，任何有毒或有害compunds蒸发。染色的蛋白质发生已经在1分钟内加热后的凝胶染色溶液和全面发展与略带蓝色的背景，完全是destained长时间洗染色bidistilled水凝胶后15-30分钟，而不会影响染色的蛋白质，带。

研究方案

第1部分：CBB染色溶液的制备

1. 60-80毫克CBB G - 250是在1升bidistilled水溶解，搅拌2-4小时。最后，3毫升浓盐酸加入搅拌一分钟，以深蓝色的解决方案，并存储在黑暗供日后使用。该解决方案可存储几个星期到几个月的时间，而不会失去其染色效率。
2. 浓盐酸应处理与常规护理UND通风​​柜下使用。最终的解决方案将在pH为2左右，所以手套，应使用和任何应避免与皮肤接触。

第2部分：SDS - PAGE电泳

1. 蛋白质样品的适当等份混合装载到终浓度为1X样缓冲液的缓冲。我们用125MM Tris/H3PO4（25 ° C时的pH值7.5），EDTA的2MM，4％SDS，200mm的数码地面电视，0.02％溴酚蓝和50％的甘油2X样缓冲液。以及可用于其他装载缓冲区进行SDS - PAGE。
2. 蛋白质样品被加热约5分钟装货前。与此同时，凝胶电泳室的运行准备。我们使用预制4-12％NuPAGE ©双三凝胶（Invitrogen公司）在XCell SureLock ®迷你细胞与MES缓冲（Invitrogen公司）作为运行缓冲液，但任何其他的凝胶电泳系统也可作为使用。
3. 蛋白质样品装入凝胶电泳在220V和50分钟的运行。

第3部分：凝胶染色

1. 凝胶盒拆卸和凝胶放置在一个盒子里，为随后的清洗步骤。
2. bidistilled水约100毫升，加入凝胶，在微波炉加热30秒。沸腾发生之前，应停止暖气。与凝胶的方块，然后放置在一个振动筛为3-5分钟。重复此清洗步骤是用新鲜水的两倍。
3. 补充足够的CBB染色的解决方案是覆盖胶框和框在微波炉中加热10秒。未经煮沸。完成染色，凝胶的方块，然后放置在一个摇床。早1分钟后，蛋白条带，可以观察到，经过15-30分钟。染色是在大多数情况下足够强。
4. 染色溶液浇灭了50-100毫升bidistilled水，以补充，以进一步destain在摇床凝胶的蓝色背景光。进一步脱色如果需要的水可以取代淡水。
5. 凝胶可以被扫描，拍照或长期贮存干燥

第4部分：代表性的成果：

见图。 1所描述的过程，一个正确的染色凝胶。

见图。一个尚未足够长的时间染色前和残留的SDS洗凝胶2，抑制高效率的染色。请注意标记的车道（*）包含相同数量的标志蛋白。

图1：代表加载后的一种蛋白质纯化的样品（分子量标记*）的凝胶染色。

图2：CBB染色凝胶尚未洗净CBB染色前足够长的时间。蛋白条带出现较弱的（请注意，标记巷*包含在图1的蛋白质相同金额）。

讨论

• 洗涤步骤是为高效的蛋白质染色是至关重要的。 2分以下或水（<50毫升）的体积缩小减少洗涤时间，可以在淡蓝色的蛋白条带，最有可能由于凝胶中残留的SDS的结果。
• 如果蛋白质质谱分析，在微波炉中加热的步骤应跳过，扩展到约10分钟，每一步和染色时间延长，直到带的强度凝胶洗涤时间足够强大。加热质谱的蛋白质的交联凝胶的凝胶基质，从而检测的蛋白质可能会受到阻碍。
• 相反的CBB G - ...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coomassie Brilliant Blue G-250	AppliChem	A3480	any other CBB G-250 could be used as well
Concentrated HCl