在小鼠胰腺β-细胞团的原位定量

摘要

以下协议概述了虚拟切片成像过程中，胰腺癌的夹层和随后所有GFP标记在整个胰腺β细胞的定量。

摘要

跟踪在健康和疾病的特定细胞群的变化是生物医学研究的一个重要目标。监测胰腺β细胞增殖和胰岛生长的过程中是特别具有挑战性。我们已经开发出一种方法来捕获完整的胰腺β细胞的分布与荧光标记的β细胞ImageJ（/ rsb.info.nih.gov / IJ）编写的宏转基因小鼠。胰腺解剖和组织清算，作为一个虚拟切片，捕获整个胰腺后，GFP标记的β细胞的研究。分析包括定量β细胞总面积，胰岛数量和大小分布参考具体参数和每个胰岛β细胞小群的位置。可以绘制整个小岛分布在三个层面，从每个胰岛的大小和形状的分布信息，允许一个整体β细胞面积的变化一目了然的定量和定性的比较。

研究方案

第1部分：试样制备

1. 下解剖镜下放置鼠标，整个胰腺仍然附着与十二指肠和脾脏中删​​除，并放在一个预先称重的载玻片机关。取出沿侧切割结缔组织，它必然胰腺十二指肠。剪切和删除对胰腺的脾和多余的脂肪，直到胰腺是幻灯片上的完全隔离。 （胰腺脂肪是从胰腺组织的颜色稍深和Tanner的区别，其白色区分开来。）
2. 将盖玻片（大盖玻璃50x75mm;标准盖玻片25x75mm）在胰腺，使其完全覆盖。使用重量（如一个沉重的书）扁平化之间的幻灯片的胰腺和它的封面。根据不同的重量，扁平化的胰腺，大约需要5分钟。
3. 起飞重量。如果胰腺是平坦的，对幻灯片，将在4％多聚甲醛（PFA），在4 ° C过夜。在早上，取出盖玻片，白天（6-8小时）暴露整个胰腺煤灰。如果胰腺是不固定的，允许它留在煤灰，可能一蹴而就。转让1％的幻灯片容器的Triton X - 100的磷酸盐的缓冲液（PBS）过夜。第二天，转让幻灯片饱和蔗糖的容器为1-2天。然后，将下滑到100％甘油的容器，直到组织被清除，这对荧光信号的最佳分辨率，允许组织清算大约需要1-3天。 （荧光信号可能会持续几周，甚至几​​个月，但成像应该执行后不久，该组织是为最佳分辨率清除。）
4. 储存在阴凉的区域胰腺，以维护机关及其荧光信号。

第2部分：成像和量化完整的胰腺β细胞的面积

1. 使用镊子或戴手套的手，容器的滑出100％的甘油。擦去多余的甘油和专门用乙醇清洗玻璃盖的背面，准备用于成像的幻灯片。
2. 打开StereoInvestigator软件（MicroBrightField，威利斯顿，VT），并选择2X物镜成像小鼠胰腺大型玻片3周以上，或10倍的物镜成像小鼠胰腺年龄小于3周两25毫米盖玻片压。可视化设置实时图像（图像→现场图像）图像。选择一个曝光时间，清楚地表明GFP标记的β细胞。 （曝光不足的图像排除较小的胰岛β细胞，而过度曝光的图像创建额外的虚假信号。）
3. 点击屏幕上的任何地方建立一个基准点，并着手拟订一个围绕整个胰腺的轮廓。启动虚拟切片的过程（图像→获取虚拟切片）。确定和选择最好的焦平面，即，具有显着的，重点突出的胰岛β细胞上滚动聚焦旋钮Z轴的数量最多的飞机。一旦选择，StereoInvestigator自动捕获屏幕上显示的图像。随着机动阶段，“虚拟切片”功能顺序捕捉每个光面板内绘制的轮廓（图1A）作为一个鲜明的形象，然后结合所有这些作为一个合并后的图像（图1B）。虚拟切片成像技术使用啶配置即过滤器，广角，让相机捕捉到的所有信号在一定的深度，包括那些不完美中的重点，使最终的虚拟片是一个集成的二维图像，是不是最大从整个胰腺三维重建的投影。平均虚拟切片扫描时间是每个样本30分钟，但可能需要长达一个小时为一个大的胰腺。
4. 保存图像后，开始开放ImageJ图像分析。当图像完成加载，并显示在屏幕上，打开和运行的虚拟切片分析的宏（补充材料 1 ）。
5. 按照提供的说明一步一步的宏观。消除光散射的“魔棒”和“选择区域”工具创建不受欢迎的文物。不必要的检查，并从图像中减去背景。确定半径最大的胰岛与“行”的工具，使随后的滚珠功能，能有效去除自体荧光和散射光。测试和选择最合适的“低门槛”，捕捉到的小胰岛β细胞群荧光信号^（<3X10 4 ^微米 2） 。测试和选择最合适的“高门槛”，捕捉到的胰岛荧光信号。运行虚拟切片的量化，将测量产生胰岛面积，周长，圆度，和FERET的直径。

图1A虚拟切片图像分析的β细胞的整个分布在一个完整的成人胰腺
在10周的一个雄性小鼠胰腺中的单个光学面板的图像下一个2倍的目标。这些图像包括整个小岛的分布，甚至小群的β细胞（<10个细胞）。

图1B虚拟切片图像分析的β细胞的整个分布在一个完整的成人胰腺
一个统一的虚拟切片与右侧背胰和腹胰左侧。比例尺为5毫米。

代表性的成果

精通虚拟切片成像胰腺准备将允许所有的有效量化GFP标记作为一个具有明确和独特的小岛的虚拟切片图像的整个胰腺的β细胞。成功的虚拟切片原位全胰腺成像提供的手段，研究和量化的β-细胞，不仅是个人和总胰岛面积，而且胰岛大小分布，区域分析，和增长方式转变以及的。虽然ImageJ维护的能力，同时在虚拟切片图像分析检测所有的β细胞，它也可以控制产生β细胞，进行量化分析，通过限制某些胰岛的尺寸（面积或直径），或由位置。一个标准的分析不包括文物，例如，比一个单一的β-细胞（<170微米）和记录的面积，周长（周边地区的距离），圆（一个圆度的程度，其中1.0代表一个完美的圆）小碎片。 FERET每个胰岛的直径（在一个区域内的最长的距离）检测。虚拟切片分析能力，提高用人的分水岭，区分和分离重叠成单个胰岛的胰岛细胞，根据它们的形状虚拟切片图像。进一步的分析产生了一系列详细的图像，这包括口罩的图像在低和高的强度（图1C），所有推定胰岛大纲，这是每个独立编号及相应的信息表中列出（图1D），和原来的虚拟切片图像（图1B）。选择可以倾斜的小岛，包括无偿光周围的大型结构的量化，或减少总数的胰岛细胞，尤其是小颗粒的微弱信号的阈值时，需要注意的是潜在的技术偏见。

图1C虚拟切片图像分析的β细胞的整个分布在一个完整的成人胰腺
在虚拟切片的荧光颗粒的面具。颜色代码：[1]蓝色：低强度的荧光; [2]绿​​色：中等强度的荧光; [3]红色：高强度的荧光。

图1D的虚拟切片图像，在一个完整的成人胰腺的β细胞的整个分布分析
量化的个别小岛/β-细胞群。请注意，每个胰岛（包括β细胞的小群）是其在相应的图表详细信息，编号。每个结构的四个参数：（1）区（2）周边;（3）循环：这里的人数1.0代表一个完美的圆某种程度的圆度;和（4）FERET的直径：在一个区域内最长的距离。请注意，＃706显示面积只有少数β-细胞分析的决议。分水岭分割检测相邻的小岛组，如所示，并适当的区分不同的胰岛细胞（胰岛1554，1555和1556），他们。

图1E虚拟切片图像分析的β细胞的整个分布在一个完整的成人胰腺
3维虚拟切片分析的情节，面积，周长，和FERET的直径的轴。每个点代表一个小岛。

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讨论

完整的胰腺中的胰岛细胞和β细胞集群的虚拟切片图像分析提供了一个大规模的看法，整个小岛分布。发展，随着时间的推移，总胰岛分布的变化，因此可以研究和比较。在我们的胰岛形成（1）分析表明了这样一个例子。在不同时间点（P1 - P21）的综合分析表明新生小鼠的胰腺，胰岛裂变形成。虽然β-细胞的增殖与小鼠的对数正态分布的概率密度函数从P1 - P10适合从P12开始，胰岛分布向左偏离距离...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	Miltex Inc.
Scissors	F.S.T.	14001-13	01n2
Scissors	F.S.T.	14072-10	02s5
Large glass slide	Electron Microscopy Sciences	71862-01	75x51x1.2mm
Large cover glass	Ted Pella, Inc.	260462	50x75mm
Glass Slide	Fisher Scientific	12-550-15	25x75x1.0mm
Cover glass	Fisher Scientific	12-458-5M	75x25mm
Cover glass	Erie Scientific		25mm circle
Fluorescent microscope	Olympus Corporation
Dissection microscope	Olympus Corporation
Stereo Investigator	MBF Bioscience
MIP-GFP mice	Jackson Laboratory