鼠标垂体免疫原的制备诱导实验性自身免疫性垂体炎

摘要

可以复制自身免疫性垂体炎在小鼠体内，小鼠垂体蛋白提取物注射。

摘要

自身免疫性垂体炎是一种慢性炎症引起或伴随着自身^免疫 1的脑下垂体。它历来被认为是一种罕见的疾病，但报告已在近年来显着增加。垂体炎，事实上，发展不寻常在块上，如CTLA - 4和PD - 1受体的T淋巴细胞，表达抑制性受体与抗体治疗癌症患者的一个“副作用“。实验小鼠注射佐剂³混合垂体蛋白质可诱发自身免疫性垂体炎。在这个视频文章中，我们演示了如何从鼠标脑垂体和如何准备他们在适合SJL小鼠诱导的自身免疫性垂体炎的形式提取的蛋白质。

研究方案

实验协议

在这个试验性的协议的第一步是收集了大量鼠标脑垂体。第二个步骤是，同质化的腺体准备蛋白提取物。第三步是油性混合物乳化这些蛋白质。

第1步：鼠标脑垂体收集和储存

鼠标脑下垂体位于颅底三叉神经和视交叉前方横向包围，在所谓蝶鞍蝶骨的抑郁症。腺体组成一个较大的前叶和较小的后部和中间叶，体重平均为1.9毫克。注定要被实施安乐死的动物护理设施的混合菌株，性别，和年龄，老鼠的脑垂体收集。

要隔离脑垂体，鼠标是安乐死，上述解剖颅骨的皮肤，并用剪刀剪开颅骨骨开放。解除大脑，脑垂体，然后从周围硬脑膜分离暴露，捞起来蝶骨上干冰的塑料管中。

一般来说，我们使用一个蛋白质的准备，可以由一人在9个小时收集的300鼠标脑垂体。

一旦收集完成，包含脑垂体管保存于-80 ° C，直到准备下一个步骤。

第2步。小鼠垂体蛋白的提取

1. 同质化的缓冲区，以添加15毫升猎鹰管（目录没有352059）保持在冰浴，每收集100脑垂体使用250的缓冲液。使用的是细胞质内的细胞生理pH（7.4）（0.2 M）和生理上的一个类似的离子强度缓冲。我们用磷酸盐缓冲液（0.161 M，pH值7.4），辅以一种蛋白酶抑制剂的鸡尾酒（Sigma - Aldrich公司，目录没有P8340 - 1ML）。
2. 添加脑垂体刚刚在同质化的缓冲区，然后将宝创匀浆发电机猎鹰管的底部（直径5毫米）。均质最高转速为30秒，轻轻移动猎鹰管向上和向下，同时保持在冰浴。然后休息1分钟冰匀浆。重复的同质化和冷却步骤两次。要打破这种温柔的同质化细胞，而不破坏的原子核并释放胞浆蛋白。
3. 要去除细胞核，完整的组织和不溶物（如结缔组织，变性的蛋白复合物），离心机在低转速（千克）的匀浆液在4 ° C 10分钟
4. 转移上清（现在叫后核上清，PNS）到一个新的猎鹰管，照顾离开颗粒不受干扰，并存储在冰上的PNS的。
5. 在同质化的缓冲区的原始卷（250μL每收集100脑垂体的缓冲区）重悬沉淀，上述均质，离心上述，然后结合第二PNS的第一个。
6. 分装在两个汇集PNS的样品到离心管中并储存在-80 ° C直到为下一步做好准备。这种蛋白制备可存放于-80 ° C，但逐渐失去其效力，因此，我们建议在6个月从筹备内使用。使用一个小等分，以确定蛋白质产量和浓度由BCA检测（皮尔斯目录。23225），并通过凝胶电泳的蛋白质质量。在一般情况下，我们从300鼠标垂体获得约60毫克的蛋白质，同质化的缓冲液在1.5毫升，在浓度40毫克/毫升左右。

第3步。免疫乳液的制备

1. 迅速解冻实验所需的冷冻蛋白等分，调整蛋白浓度为20毫克/毫升。将这种蛋白质提取物乳化1:1与完全弗氏佐剂（终审法院，Sigma公司的F - 5881）含有5毫克/毫升杀害结核分枝杆菌（Becton Dickinson公司，231141）的热量。每个鼠标将获得1毫克的垂体提取物在100μL乳液。
2. 这里给出的例子是免疫10只小鼠，其中每个鼠标将注入100μL含有1毫克垂体蛋白质的乳液。允许两个额外的小鼠物质损失，所以在准备使用12毫克垂体蛋白质。上面描述的使用2.5毫升汉密尔顿气密性注射器的Aspire 600μL的20毫克/毫升垂体蛋白提取物。重悬通过晃动终审法院，并渴望进入另一个2.5 mL的汉密尔顿注射器的600μL的终审法院。连接和安全的一个22号的微乳化针头与终审法院填补了注射器。慢慢推针是与终审法院填补的终审法院注射器的柱塞，然后连接和安全的另一端充满垂体提取物的注射器针头。
3. 慢慢推进终审法院的注射器的柱塞推入acqueous脑垂体提取物，这样，只有少量混合油成分。然后向后推到终审法院的注射器柱塞的脑垂体中提取注射器。逐步增加混合材料的数量，重复此动作。继续混合，直到两个注射器的全部内容。您将获得代表的油包水型乳化发白和均匀分布的解决方案。
4. 一旦形成乳液，至少有500次重复的往复运动，以确保完全混合乳液。最终混合周期后，1:1的油包水型乳化液就可以使用，包含垂体蛋白浓度为10毫克/毫升。乳化将在同一天注射，皮下麻醉SJL小鼠，在同伴的Jove文章详细。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

尽管自身免疫性垂体炎的第一个病人是在1962 ^年第4期报道，垂体自身抗原的致病性^仍有待确定5。动物模型是非常有用的，以确定这些自身抗原的，协助的生物标志物，是可翻译的病人护理的发现。本文演示了一个简单的程序，准备在垂体蛋白质的形式，在实验动物诱发自身免疫性垂体炎是足够的。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15-ml Falcon tubes
homogenization buffer
phosphate buffered saline
protease inhibitor cocktail
Polytron homogenizer
BCA assay	Pierce, Thermo Scientific	23225
Complete Freund’s Adjuvant (CFA)	Sigma-Aldrich	F-5881
Mycobacterium tuberculosis	BD Biosciences	231141
2.5 mL Hamilton gastight syringe
22-gauge micro-emulsifying needle