Préparation de la souris Immunogène hypophysaires pour l'induction de hypophysite auto-immune expérimentale

Résumé

Hypophysite auto-immunes peuvent être reproduits chez la souris par injection d'un extrait de protéines de l'hypophyse de souris.

Résumé

Hypophysite auto-immune est une inflammation chronique de la glande pituitaire provoqué ou accompagné ^d'une auto-immunité. Il a traditionnellement été considérée comme une maladie rare, mais des rapports a nettement augmenté ces dernières années. Hypophysite, en fait, il n'est pas rare que se développe un «effet secondaire» chez les patients cancéreux traités avec des anticorps qui bloquent les récepteurs inhibiteurs exprimés sur les lymphocytes T, tels que CTLA-4 ² et PD-1 récepteurs. Hypophysite auto-immunes peuvent être induite expérimentalement en injectant des souris avec des protéines pituitaires mélangé avec un adjuvant ^3. Dans cet article, nous montrons comment la vidéo pour en extraire les protéines de souris glandes pituitaire et comment les préparer sous une forme appropriée pour induire hypophysite auto-immunes chez la souris SJL.

Protocole

Protocole expérimental

La première étape de ce protocole expérimental est de collecter un grand nombre de glandes pituitaires de souris. La deuxième étape consiste à homogénéiser les glandes de préparer un extrait de protéine. La troisième étape consiste à émulsifier ces protéines avec un mélange d'hydrocarbures.

Étape 1: Collecte et stockage des glandes pituitaires de souris

La glande pituitaire de souris se trouve à la base du crâne dans une dépression de l'os sphénoïde appelée la selle turcique, entouré latéralement par les nerfs trijumeau et en avant par le chiasma optique. La glande est composée d'un grand lobe antérieur et les petits lobes postérieurs et intermédiaires, et pèse en moyenne 1,9 mg. Glandes hypophysaires sont collectées à partir de souches de souris mixtes, les sexes et les âges, destinée à être euthanasié par l'établissement de soins pour animaux.

Pour isoler la glande pituitaire, la souris est euthanasié, la peau au-dessus du crâne disséqué, et l'os du crâne à ciel ouvert avec des ciseaux. Le cerveau est levé pour exposer la glande pituitaire, qui est alors isolé de la dure entourant mère, évidé de l'os sphénoïde et stocké dans un tube en plastique sur la glace sèche.

En général, nous utilisons 300 glandes pituitaires de souris pour une préparation de protéines, un nombre qui peut être recueilli par une personne en 9 heures.

Une fois la collecte terminée, le tube contenant l'hypophyse est stocké à -80 ° C jusqu'au moment de l'étape suivante.

Etape 2. Extraction de la souris protéines pituitaires

1. Ajouter le tampon d'homogénéisation d'un tube de 15 ml Falcon (no 352059) conservés dans un bain de glace, en utilisant 250 uL de tampon pour chaque 100 hypophyses collectées. Utilisez un tampon de force ionique semblable à celui qui est physiologiquement présents à l'intérieur du cytoplasme de la cellule (0,2 M) et du pH physiologique (7,4). Nous utilisons tampon phosphate salin (0,161 M, pH 7,4), complété par un cocktail inhibiteur de protéase (Sigma-Aldrich, no de catalogue P8340-1ml).
2. Ajouter les glandes pituitaires pour le tampon juste avant l'homogénéisation, puis placer le générateur (5 mm de diamètre) de l'homogénéisateur Polytron au fond du tube Falcon. Homogénéiser au régime maximum pendant 30 secondes, doucement déplacer le tube Falcon de haut en bas tout en le gardant dans le bain de glace. Ensuite, repos de l'homogénat sur la glace pendant 1 min. Répétez l'homogénéisation et le refroidissement étapes deux fois plus. Cette homogénéisation douce devrait casser les cellules et la libération des protéines cytosoliques, sans perturber les noyaux.
3. Pour enlever les noyaux, les tissus et les matières insolubles ininterrompue (comme le tissu conjonctif et des complexes protéine dénaturée), Centrifuger l'homogénat à basse vitesse (1000g) pendant 10 min à 4 ° C.
4. Transférer le surnageant (maintenant appelée post-nucléaire surnageant, SNP) dans un nouveau tube Falcon, en prenant soin de laisser intact le culot, et de stocker les SNP sur la glace.
5. Reprendre le culot dans le premier volume de tampon d'homogénéisation (250 uL de tampon pour chaque 100 hypophyses collectées), homogénéiser comme ci-dessus, centrifuger comme ci-dessus, puis combiner les SNP second avec le premier.
6. Aliquoter les deux échantillons groupés de SNP dans des tubes à centrifuger et conserver à -80 ° C jusqu'à ce que prêt pour l'étape suivante. Cette préparation de protéines peuvent être conservés à -80 ° C mais perd progressivement de sa puissance, nous vous recommandons de l'utiliser dans les 6 mois à partir de la préparation. Utilisez une petite aliquote de déterminer le rendement en protéines et la concentration par le dosage BCA (Pierce catalogue non. 23225), et la qualité des protéines par électrophorèse sur gel. En général, on obtient environ 60 mg de protéine de 300 hypophyses de souris dans 1,5 ml de tampon d'homogénéisation, à une concentration d'environ 40 mg / mL.

Étape 3. Préparation de l'émulsion pour la vaccination

1. Dégel rapidement les protéines aliquotes congelés nécessaire pour l'expérience et d'ajuster la concentration en protéines à 20 mg / mL. Cet extrait protéique sera émulsionnée 01h01 avec l'adjuvant complet de Freund (CFA, Sigma F-5881) contenant 5 mg / ml de chaleur a tué Mycobacterium tuberculosis (Becton Dickinson, 231141). Chaque souris reçoit 1 mg d'extrait pituitaire dans 100 ul d'émulsion.
2. L'exemple donné ici est pour immuniser des souris 10, où chaque souris seront injectés avec 100 pi de l'émulsion contenant 1 mg de protéines pituitaire. Autoriser deux souris supplémentaire pour pertes matérielles lors de la préparation, donc à utiliser 12 mg de protéines pituitaire. Aspire 600 uL des 20 mg / ml d'extrait de protéines pituitaires décrit ci-dessus en utilisant un 2,5 mL Hamilton étanche seringue. Reprendre le CFA en secouant, et aspirer 600 pi de CFA dans une autre seringue de 2,5 mL de Hamilton. Attacher et sécuriser un calibre 22 micro-émulsification aiguille à la seringue remplie de CFA. Poussez lentement le piston de la seringue CFA tels que l'aiguille est rempli avec le CFA, puis attacher et sécuriser l'autre extrémité dul'aiguille à la seringue remplie avec de l'extrait pituitaire.
3. Lentement avancer le piston de la seringue CFA pour pousser la composante de l'huile dans l'extrait aqueuse hypophyse, de telle sorte que seule une petite quantité est mélangée. Puis repousser le piston de la seringue extrait pituitaire dans la seringue CFA. Répétez cette action en augmentant progressivement la quantité de matériaux mixtes. Continuez jusqu'à ce que tout le contenu des deux seringues sont mélangés. Vous obtiendrez une solution blanchâtre et uniformément répartie, qui représente l'émulsion eau-dans-huile.
4. Une fois l'émulsion est formée, répétez le mouvement de va-et-vient au moins 500 fois pour assurer l'émulsion est bien mélangé. Après le dernier cycle de mélange, l'eau-01h01 dans-huile est prête à utiliser et contient une concentration en protéine hypophysaire de 10 mg / mL. L'émulsion sera injecté le même jour sous-cutanée dans des souris SJL anesthésiés, comme détaillé dans l'article JoVE compagnon.

Discussion

Malgré le fait que le premier patient avec hypophysite auto-immune a été signalé en 1962 ^4, les auto-antigènes pathogènes hypophysaires restent à identifier ^5. Les modèles animaux peut être très utile d'identifier ces auto-antigènes, facilitant la découverte de biomarqueurs qui sont traduisibles les soins aux patients. Cet article a démontré une procédure simple pour la préparation de protéines pituitaire dans une forme qui est suffisante pour induire hypophysite auto-immunes c...

matériels

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
15-ml Falcon tubes
homogenization buffer
phosphate buffered saline
protease inhibitor cocktail
Polytron homogenizer
BCA assay		Pierce	23225
Complete Freund's Adjuvant (CFA)		Sigma	F-5881
Mycobacterium tuberculosis		Becton Dickinson	231141
2.5 mL Hamilton gastight syringe
22-gauge micro-emulsifying needle