Preparazione di Immunogeno mouse ipofisari per l'induzione di ipofisite autoimmune sperimentale

Riepilogo

Ipofisite autoimmune può essere riprodotta nei topi iniettando un estratto di proteine ​​del mouse pituitaria.

Abstract

Ipofisite autoimmune è una infiammazione cronica della ghiandola pituitaria causata o accompagnati da autoimmunità ^1. E 'stata tradizionalmente considerata una malattia rara ma segnalazione è aumentato notevolmente negli ultimi anni. Ipofisite, infatti, non si sviluppa raramente come un "effetto collaterale" nei pazienti con tumore trattati con anticorpi che bloccano i recettori inibitori espressi sui linfociti T, come CTLA-4 ² e PD-1 recettori. Ipofisite autoimmune può essere indotta sperimentalmente iniettando nei topi con le proteine ​​pituitaria mescolato con un adiuvante ^3. In questo articolo video che dimostrano come estrarre proteine ​​dal topo ghiandola pituitaria e su come prepararli in una forma adatta per indurre ipofisite autoimmune in topi SJL.

Protocollo

Protocollo sperimentale

Il primo passo in questo protocollo sperimentale è quello di raccogliere un gran numero di topo ghiandola pituitaria. Il secondo passo è quello di omogeneizzare le ghiandole a preparare un estratto di proteine. Il terzo passo è quello di emulsionare queste proteine ​​con una miscela di idrocarburi.

Fase 1: Raccolta e conservazione di mouse ghiandola pituitaria

La ghiandola pituitaria del mouse si trova alla base del cranio in una depressione dello sfenoide detta sella turcica, circondato lateralmente dai nervi trigemino e anteriormente dal chiasma ottico. La ghiandola è composta da un lobo anteriore più ampia e più piccoli lobi posteriori e intermedi, e pesa in media 1,9 mg. Ghiandola pituitaria sono raccolti dai topi di ceppi misti, i sessi e di età, destinato ad essere l'eutanasia dalla struttura di cura degli animali.

Per isolare la ghiandola pituitaria, il mouse è eutanasia, la pelle sopra il cranio sezionato, e l'osso del cranio taglio aperto con le forbici. Il cervello viene sollevato per esporre la ghiandola pituitaria, che viene poi isolato dalla dura mater circostante, scavato dello sfenoide e conservati in un tubo di plastica in ghiaccio secco.

In generale usiamo 300 ghiandola pituitaria del mouse per una preparazione di proteine, un numero che può essere raccolta da una sola persona in 9 ore.

Una volta che la collezione è completata, il tubo contenente la ghiandola pituitaria è conservato a -80 ° C fino al momento per il passo successivo.

Fase 2. Estrazione di proteine ​​del mouse pituitaria

1. Aggiungere la soluzione tampone di omogeneizzazione ad un tubo da 15 ml Falcon (catalogo n. 352059) conservati in un bagno di ghiaccio, con 250 microlitri di tampone per ogni 100 ghiandola pituitaria raccolti. Utilizzare un tampone di forza ionica simile a quello che è fisiologicamente presente all'interno del citoplasma della cellula (0,2 M) e del pH fisiologico (7,4). Noi usiamo tampone fosfato (0,161 M, pH 7,4), integrato con un cocktail di inibitori delle proteasi (Sigma-Aldrich, catalogo n. P8340-1 ml).
2. Aggiungere la ghiandola pituitaria al buffer poco prima omogeneizzazione, quindi posizionare il generatore (5-mm di diametro) del omogeneizzatore Polytron sul fondo della provetta Falcon. Omogeneizzare a giri massimo per 30 secondi, spostare delicatamente il tubo Falcon su e giù mantenendolo nel bagno di ghiaccio. Poi, il resto l'omogenato in ghiaccio per 1 min. Ripetere l'omogeneizzazione e raffreddamento passi due volte. Questa omogeneizzazione dolce deve rompere le cellule e il rilascio delle proteine ​​citosoliche senza interrompere i nuclei.
3. Per rimuovere i nuclei, tessuto ininterrotto e materiali insolubili (come il tessuto connettivo e complessi di proteine ​​denaturate), centrifugare la omogenato a bassa velocità (1000 g) per 10 minuti a 4 ° C.
4. Trasferire il surnatante (ora si chiama post-nucleare supernatante, PNS) in una nuova provetta Falcon, avendo cura di lasciare indisturbato il pellet, e memorizzare il PNS sul ghiaccio.
5. Risospendere il pellet nel volume originale di buffer di omogeneizzazione (250 ml di buffer per ogni 100 ghiandola pituitaria raccolti), omogeneizzare come sopra, centrifuga come sopra, e poi unire il PNS secondo con il primo.
6. Aliquota i due campioni raccolti in provette da microcentrifuga PNS e conservare a -80 ° C fino al momento per il passo successivo. Questa preparazione di proteine ​​possono essere conservati a -80 ° C ma perde gradualmente la sua potenza, per cui si consiglia di utilizzarlo entro 6 mesi dalla preparazione. Utilizzare una piccola aliquota per determinare la resa di proteine ​​e la concentrazione dal saggio BCA (Pierce catalogo no. 23.225), e la qualità delle proteine ​​mediante elettroforesi su gel. In generale, si ottengono circa 60 mg di proteina da 300 pituitaries mouse in 1,5 mL di buffer di omogeneizzazione, ad una concentrazione di circa 40 mg / mL.

Fase 3. Preparazione della emulsione per l'immunizzazione

1. Scongelare rapidamente le aliquote proteina congelato necessari per l'esperimento e regolare la concentrazione di proteine ​​a 20 mg / mL. Questo estratto proteico sarà emulsionato 1:1 con adiuvante completo di Freund (CFA, Sigma F-5881) contenente 5 mg / mL di calore ucciso Mycobacterium tuberculosis (Becton Dickinson, 231.141). Ogni topo riceverà 1 mg di estratto pituitario in 100 ml di emulsione.
2. L'esempio dato ecco per 10 immunizzando topi, dove ogni mouse saranno iniettati con 100 l di emulsione contenente 1 mg di proteine ​​pituitaria. Consentono a due topi in più per la perdita di materiale durante la preparazione, in modo da utilizzare al massimo 12 mg di proteine ​​pituitaria. Aspire 600 microlitri della mg / ml 20 estratto proteico pituitario descritto sopra utilizzando una siringa da 2,5 ml di Hamilton a tenuta di gas. Risospendere il CFA agitando, e aspira 600 ml di CFA in un'altra siringa da 2,5 ml Hamilton. Attaccare e garantire un 22-gauge micro-emulsione ago alla siringa piena di CFA. Spingere lentamente lo stantuffo della siringa CFA in modo che l'ago è pieno di CFA, quindi collegare e fissare l'altra estremità dell'ago della siringa riempita con l'estratto di ipofisi.
3. Lentamente avanzare lo stantuffo della siringa CFA per spingere la componente del petrolio estratto acquoso nella pituitaria, in modo tale che solo una piccola quantità è misto. Poi spingere indietro lo stantuffo della siringa estratto pituitario nella siringa CFA. Ripetete questa azione aumentando gradualmente la quantità di materiale misto. Continuare fino a quando l'intero contenuto delle due siringhe sono mescolati. Otterrete una soluzione biancastra e uniformemente distribuito che rappresenta l'acqua in emulsione di olio.
4. Una volta che l'emulsione è formata, ripetere la parte posteriore e indietro movimento almeno 500 volte a garantire l'emulsione è accuratamente miscelati. Dopo il ciclo finale di miscelazione, il rapporto 1:1 acqua in emulsione olio è pronto all'uso e contiene una concentrazione pituitaria proteina di 10 mg / ml. L'emulsione verrà iniettato lo stesso giorno per via sottocutanea in topi anestetizzati SJL, come dettagliato nell'articolo JOVE compagno.

Discussione

Nonostante il fatto che il primo paziente con ipofisite autoimmune è stato segnalato nel 1962 ^4, l'ipofisi autoantigeni patogeni devono essere ancora identificate ^5. I modelli animali possono essere molto utili per identificare questi autoantigeni, favorendo la scoperta di biomarcatori che sono traducibili alla cura del paziente. Questo articolo ha dimostrato una procedura semplice per la preparazione di proteine ​​pituitaria in una forma che è sufficiente per indurre ipofisite autoimmuni...

Materiali

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
15-ml Falcon tubes
homogenization buffer
phosphate buffered saline
protease inhibitor cocktail
Polytron homogenizer
BCA assay		Pierce	23225
Complete Freund's Adjuvant (CFA)		Sigma	F-5881
Mycobacterium tuberculosis		Becton Dickinson	231141
2.5 mL Hamilton gastight syringe
22-gauge micro-emulsifying needle