Preparação de rato Imunogénio Pituitária para a indução de hipofisite Auto-Imune Experimental

Resumo

Hipofisite auto-imune pode ser reproduzido em ratos através da injeção de um extrato de proteínas do mouse pituitária.

Resumo

Hipofisite auto-imune é uma inflamação crônica da glândula pituitária causada ou acompanhada de auto-imunidade ^1. Ela tem sido tradicionalmente considerada uma doença rara, mas relatórios tem aumentado significativamente nos últimos anos. Hipofisite, de fato, não raro se desenvolve como um "efeito colateral" em pacientes com câncer tratados com anticorpos que bloqueiam os receptores inibitórios expressa nos linfócitos T, como CTLA-4 ² e PD-1 receptores. Hipofisite auto-imune pode ser induzida experimentalmente pela injeção de ratos com proteínas pituitária misturado com um ³ adjuvante. Neste artigo de vídeo demonstramos como extrair proteínas de rato pituitária glândulas e como prepará-los de forma adequada para induzir hipofisite auto-imunes em camundongos SJL.

Protocolo

Protocolo Experimental

O primeiro passo neste protocolo experimental é coletar um grande número de glândulas pituitária de rato. O segundo passo é homogeneizar as glândulas para preparar um extrato de proteína. A terceira etapa é para emulsionar estas proteínas com uma mistura de hidrocarbonetos.

Passo 1: Recolha e armazenamento das glândulas pituitária de rato

A glândula pituitária do mouse fica na base do crânio em uma depressão do osso esfenóide chamada sela túrcica, cercado lateralmente pelos nervos trigêmeo e anteriormente pelo quiasma óptico. A glândula é composta de um grande lobo anterior e menor lóbulos posterior e intermédio, e pesa em média 1,9 mg. Glândula pituitária são coletados de camundongos de linhagens mistas, sexos e idades, destinado a ser sacrificados pela facilidade de cuidado animal.

Para isolar a glândula pituitária, o mouse é eutanásia, a pele acima do crânio dissecado, eo osso do crânio cortado com uma tesoura. O cérebro é levantada para expor a glândula pituitária, que é então isolado da dura-máter ao redor, escavou para fora do osso esfenóide e armazenadas em um tubo de plástico em gelo seco.

Em geral, usamos 300 glândulas pituitária do mouse para uma preparação de proteínas, um número que pode ser recolhida por uma pessoa em nove horas.

Depois que a coleção estiver completa, o tubo que contém as glândulas pituitária é armazenada a -80 ° C até que esteja pronto para a próxima etapa.

Etapa 2. Extração de proteínas do mouse pituitária

1. Adicione o tampão de homogeneização para um tubo Falcon de 15 ml (catálogo não 352.059) mantidos em um banho de gelo, com 250 mL de tampão para cada 100 glândulas pituitárias coletados. Use um buffer de força iônica semelhante à que é fisiologicamente presente no interior do citoplasma da célula (0,2 M) e de pH fisiológico (7,4). Nós usamos tampão fosfato (0,161 M, pH 7,4), complementado com um coquetel inibidor de protease (Sigma-Aldrich, o catálogo não-P8340 1 ml).
2. Adicione a glândula pituitária para o buffer antes da homogeneização, e em seguida, coloque o gerador (5 mm de diâmetro) do homogeneizador Polytron no fundo do tubo Falcon. Homogeneizar em rpm máxima por 30 segundos, movendo-se delicadamente o tubo Falcon cima e para baixo, mantendo-o em banho de gelo. Então, o resto homogeneizado em gelo por 1 min. Repita a homogeneização e resfriamento passos mais duas vezes. Esta homogeneização suave deve quebrar as células e liberação de proteínas citosólicas sem interromper os núcleos.
3. Para remover o tecido núcleos, ininterrupta e materiais insolúveis (como tecido conjuntivo e complexos de proteína desnaturada), centrifugar o homogeneizado a baixa velocidade (1000g) por 10 min a 4 ° C.
4. Transferir o sobrenadante (agora chamado de Post-Nuclear sobrenadante, PNS) para um tubo Falcon nova, tendo o cuidado de deixar o pellet intacta, e armazenar o PNS no gelo.
5. Ressuspender o sedimento em volume original de tampão de homogeneização (250 mL de tampão para cada 100 glândulas pituitárias coletados), homogeneizar como acima, centrífuga como acima, e depois combinar o PNS segundo com o primeiro.
6. Alíquota as duas amostras agrupadas PNS em tubos de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C até que esteja pronto para a próxima etapa. Esta preparação proteína podem ser armazenadas a -80 ° C, mas aos poucos perde sua potência, por isso recomendamos a usá-lo dentro de 6 meses a partir da preparação. Use uma pequena alíquota para determinar a produção de proteína e concentração pelo ensaio BCA (Pierce catálogo no. 23.225), ea qualidade da proteína por electroforese em gel. Em geral, obtém-se cerca de 60 mg de proteína de 300 hipófises de rato em 1,5 mL de tampão de homogeneização, a uma concentração em torno de 40 mg / mL.

Etapa 3. Preparação da emulsão para a imunização

1. Descongele rapidamente as alíquotas de proteína congelados necessário para a experiência e ajustar a concentração de proteína de 20 mg / mL. Este extrato de proteína será emulsificada com adjuvante Freund 01:01 completo (CFA, Sigma F-5881), contendo 5 mg / mL de calor matou Mycobacterium tuberculosis (Becton Dickinson, 231.141). Cada rato vai receber 1 mg de extrato de hipófise em 100 mL de emulsão.
2. O exemplo dado aqui é para imunizar 10 ratos, onde cada rato serão injetados com 100 mL da emulsão contendo 1 mg de proteínas pituitária. Permitir que dois ratos extra para perda de material durante a preparação, então use 12 mg de proteínas pituitária. Aspire mL 600 dos 20 extrato de proteína mg / mL pituitária descrever acima usando uma seringa de 2,5 ml Hamilton herméticos. Ressuspender o CFA por agitação, e aspiramos 600 mL de CFA em mais 2,5 mL seringa Hamilton. Anexar e garantir uma agulha de calibre 22 micro-emulsionantes para a seringa cheia com CFA. Empurre lentamente o êmbolo da seringa CFA de tal forma que a agulha é preenchido com CFA, em seguida, anexar e segura a outra extremidade doa agulha para a seringa cheia com extrato de pituitária.
3. Lentamente avançar o êmbolo da seringa CFA para empurrar o componente óleo no extrato de pituitária aquosa, de modo que apenas uma pequena quantidade é misto. Em seguida, empurre o êmbolo da seringa extrato de hipófise na seringa CFA. Repita esta acção gradualmente aumentando a quantidade de material misturado. Continue até que todo o conteúdo das duas seringas são misturados. Você vai obter uma solução esbranquiçadas e distribuídas uniformemente que representa a emulsão de água em óleo.
4. Uma vez que a emulsão é formada, repita o movimento de vai-e-vem, pelo menos, 500 vezes para garantir a emulsão é bem misturado. Após o ciclo final de mixagem, de 1:1 de água em óleo, emulsão está pronto para usar e contém uma concentração de proteína pituitária de 10 mg / mL. A emulsão será injetado no mesmo dia por via subcutânea em ratos anestesiados SJL, conforme detalhado no artigo JOVE companheiro.

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Discussão

Apesar do fato de que o primeiro paciente com hipofisite auto-imune foi relatada em 1962 ^4, a auto-antígenos patogênicos pituitária continuam a ser identificados ^5. Modelos animais podem ser muito úteis para identificar esses auto-antígenos, auxiliando na descoberta de biomarcadores que são traduzíveis para o atendimento ao paciente. Este artigo tem demonstrado um procedimento simples para preparação de proteínas pituitária de uma forma que é adequada para induzir hipofisite auto-imunes...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15-ml Falcon tubes
homogenization buffer
phosphate buffered saline
protease inhibitor cocktail
Polytron homogenizer
BCA assay	Pierce, Thermo Scientific	23225
Complete Freund’s Adjuvant (CFA)	Sigma-Aldrich	F-5881
Mycobacterium tuberculosis	BD Biosciences	231141
2.5 mL Hamilton gastight syringe
22-gauge micro-emulsifying needle