改性膜联蛋白V /碘化丙啶检测细胞凋亡细胞死亡的准确评估

摘要

为评估细胞死亡的一种准确的方法是描述。该协议改进传统的膜联蛋白V /碘化丙碘化物（PI）的协议，这显示多达40％的假阳性的细胞株和原代细胞的动物模型的广泛事件。

摘要

细胞凋亡的研究有了显着的影响以来，流式细胞仪为基础的方法的引进。碘化丙啶（PI）是广泛用于与Annexin V的结合来确定，如果细胞通过质膜的完整性和通透性^1,2差异可行的，凋亡，或坏死。膜联蛋白V / PI协议是一个常用的方法，为研究^细胞凋亡3。 PI是，往往比其他核污渍，因为它是经济，稳定和细胞活力的一个良好指标，根据其能力，以排除在^活细胞4,5染料。 PI的进入细胞的能力是依赖于细胞膜的通透性; PI不染色居住或早期由于存在一个完整的^质膜 1,2,6的细胞凋亡。晚期凋亡和坏死细胞，血浆和核膜的完整性^下降 7,8，使PI传递透过膜，插成核酸，并显示红色^荧光 1,2,9 。不幸的是，我们发现，传统的膜联蛋白V / PI双协议导致大量的误报事件（高达40％），这是与PI染色的RNA ^在细胞质车厢10。原代细胞和细胞株在动物模型的广泛影响，大细胞:显示最高^的发生10（核细胞质比率<0.5 ）。在这里，我们展示了修改后的膜联蛋白V / PI方法，提供了一个评估与常规方法相比，细胞死亡的显着改善。该协议需要在修复细胞，促进一成以下的染色细胞的RNase进入细胞通透性的变化。的时间和浓度的RNase一个已经优化去除细胞质RNA。结果是比传统的膜联蛋白V / PI协议（<5％，与细胞质PI染色的事件）的显着改善。

研究方案

执行此过程可在500μL的硅化管或6毫升聚苯乙烯圆底流式细胞仪管。后者通常是与其他程序一起进行可行性分析时使用。所有卷6毫升聚苯乙烯圆底流式细胞仪管。 500μL的硅化管，减少了1 / 5的所有卷。

流式细胞仪分析的最佳浓度为2-4 × ¹⁰ 6细胞，每200μL体积。细胞的损失可能会导致此过程，因此，我们建议每个样本程序开始在4 × ^{10 6个}细胞组成。

1。细胞制备

1. 收获细胞 - 指相应的细胞系或原电池隔离的具体程序。
2. 离心机在335 X克的样品为10分钟，倒出上清液。
3. 悬浮细胞在2毫升1 ×磷酸盐缓冲液（PBS） ^{- / - （}无钙，镁）。
4. 离心机在335 X克的样品为10分钟，倒出上清液。
5. 在1毫升1 × Annexin V的结合缓冲液重悬细胞。
6. 离心机在335 X克的样品为10分钟，倒出上清液。
7. 100μL的1 × Annexin V的结合缓冲液中的悬浮细胞。

2。应用膜联蛋白V / PI染色

1. 根据制造商的建议，加入Annexin V的[例如5μLAnnexin V的的Alexa Fluor 488（分子探针，A13201）]。
2. 在黑暗中为15分钟，在室温下孵育管。
3. 到每个反应管中加入100μL1 × Annexin V的结合缓冲液。应该有大约200μL每管。
4. 新增4μL的PI（Sigma公司，猫的P - 4864 - 10ML）已稀释在1 × Annexin V的结合缓冲液（即1μL9μL，1 × Annexin V的结合缓冲液PI）1:10。这将产生一个最终的PI浓度2微克/毫升每个样品。
5. 在黑暗中为15分钟，在室温下孵育管。
6. 加入500μL，1 × Annexin V的结合缓冲液洗细胞。
7. 离心机在335 X克的样品为10分钟，倒出上清液。
8. 500μL的1 × Annexin V的结合缓冲液和500μL2％的甲醛，创建一个1％的甲醛（固定液）解决方案中的悬浮细胞。混合管轻轻弹。
9. 固定在10分钟的冰样本。此外，样品可以存储在一夜之间在4 ° C黑暗环境中。如果选择了后一种方法是，确保跨越用膜联蛋白V / PI（包括补偿控制）标记的所有管。
10. 加入1毫升1 × PBS ^-每个样品和混合轻轻弹^{- /。}
11. 425 X克离心管8分钟，倒出上清液。
12. 重复步骤2.10和2.11。
13. 悬浮沉淀弹管。
14. 加入16μL1:100稀释的RNA酶A（Sigma公司，R4642），给予终浓度为50微克/毫升。 15分钟在37 ° C。
15. 加入1毫升1 × PBS ^{- / -}混合，轻轻地弹。
16. 425 X克八分钟离心管。
17. 要分析的样品现在已经准备好。此外，样品可以用于后续的染色步骤，如果膜联蛋白/ PI染色正在与其他程序的并行执行。

3。代表性的成果:

如图1所示，有不同程度的假阳性PI染色的细胞类型和细胞系的例子。要考虑为假阳性事件，细胞固定，然后用RNase A的看待这个结果在假阳性事件的数量显着减少，细胞相比，没有经过核糖核酸治疗（图2B）。图2C显示行核糖核酸治疗的细胞，细胞没有核糖核酸治疗相比，代表图像。图3显示了如何与固定和RNase处理步骤修改后的膜联蛋白V / PI双协议，通过限制假阳性染色事件的数量，提高常规协议。

图1。传统的碘化丙啶染色协议导致大量的误报事件 。，我们曾评估跨越广泛的动物模型，以及在^多种细胞系10假跨原代细胞的阳性染色程度。代表的图像显示在三个独特的细胞群（一个常用的细胞株 - RAW巨噬细胞和两个主要的细胞 - 小鼠骨髓巨噬细胞（BMM）的金鱼原发性肾脏巨噬细胞（PKM））的假阳性染色程度。真阳性事件显示核车厢内的预期之间的PI和DRAQ5的合作本地化（黄色区域描绘PI和DRAQ5之间的共定位）。 DRAQ5是高度membraNE渗透性染料，准确污渍核舱在活的和死的^细胞 10,11,12 。为了方便视觉决心共定位DRAQ5染色绿色pseudocolour。

图2。提高PI核染色的准确性。 （一）我们评估的PI基于一个良好的特点核污渍的数量（BrdU，7 - AAD和DAPI）的相似性DRAQ5程度的核染色的准确性。 BrdU是一种人工合成的核苷纳入增殖细胞的DNA，因此只会弄脏核车厢内。 7 - AAD有一个高亲和力的DNA，类似为PI，不能跨越一个完整的质膜。的DAPI也有很强的亲和力的DNA，是最常用的核染色荧光显微镜。 BrdU，7 - AAD，DAPI染色和DRAQ5之间的相似程度> 99％，突出自己的能力，准确地在RAW 264.7巨噬细胞的细胞核染色。相比之下，基于传统协议的细胞质PI染色％的染色相对DRAQ5相似的一个显着减少。 （二）观察到类似的结果在两个主要测试细胞:小鼠骨髓巨噬细胞（BMM）的金鱼原发性肾脏巨噬细胞（PKM）。 50微克/毫升核糖核酸酶在染色过程中特定阶段的一个团，消除非核PI染色，显着增加的相似程度相对DRAQ5染色。 （三）原发性肾脏巨噬细胞的具有代表性的图像显示为核糖核酸酶治疗和无细胞的相似程度。为了方便治疗之间的视觉差异的决心，DRAQ5绿色。黄色区域描绘BrdU和DRAQ5，有价证券和DRAQ5之间的共定位。

图3。改性膜联蛋白V / PI显着降低虚假凋亡/坏死事件。小金鱼肾巨噬细胞（PKM）染色与传统的和修改过的膜联蛋白V / PI协议。散点图描述膜联蛋白V / PI双染色金鱼的PKM。左边的散点图显示传统PKM的细胞的膜联蛋白V / PI染色（无核糖核酸）。在右边的散点图显示与修改后的膜联蛋白V / PI双协议（核糖核酸）染色PKM细胞。此外核糖核酸酶中的一个显着减少因假阳性污渍的去除PI染色的结果。 PKM的细胞，然后进行分析的基础上文化早期祖细胞内的不同人群（EP），单核细胞（单声道）和成熟的巨噬细胞（垫MAC）。积极PI事件的数量减少，由于去除误报事件是在大的成熟的巨噬细胞更明显比在较小的早期祖细胞。在传统的协议为基础的结论有误提出一个较为成熟的巨噬细胞亚群的细胞死亡中的积极的关系。

讨论

膜联蛋白V / PI双协议这里介绍的是常规协议的修改后的版本，并考虑到存在的RNA在细胞质中也有PI高亲和力。介绍RNA酶A（50微克/毫升）以下1％的甲醛固定在染色过程中的步骤，大大提高了核PI染色的准确性。核PI染色或细胞膜Annexin V的染色观察到任何负面影响。没有核糖核酸酶A治疗，高达40％的PI染色结果可能会导致误报事件，从而导致潜在的重大负面影响上下游结论^10。

修改后的膜联蛋白V / PI染色协议很简单，在一个广泛的细胞类型（ 原代细胞已被用于有效的小鼠骨髓巨噬细胞和脾;猪肺居民细胞，肺泡巨噬细胞，肠系膜淋巴结分离，外周血白细胞脾;鸡胚细胞;金鱼原发性肾脏巨噬细胞;鲤鱼外周血白细胞;细胞株RAW 264.7巨噬，Jurkat T细胞，猪3D4/31巨噬，金鱼鱼翅纤维母细胞CCL - 71，3B11鲶^鱼 B细胞10）。重要的是要注意假阳性PI染色，与原代细胞一般有^虚假的10个阳性事件较多，影响细胞的差异。虚假的差异，这些细胞群之间的积极PI染色可部分归因于细胞大小的差异，但也可能会导致RNA含量的差异。因此，此过程纳入特别是有关的实验系统，利用，等等，细胞遗传毒性应激，细胞与细胞周期逮捕胸苷或羟基脲等药物，病毒感染的细胞，对胚胎干细胞里发育进程的研究治疗特点是RNA的合成离散变化。

材料

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
1 x PBS-/-
1 x Annexin V Binding Buffer		BD Biosciences	556454
Annexin V-Alexa Fluor 488		Molecular Probes (Invitrogen)	A13201
Propidium iodide (PI)		Sigma-Aldrich	P4864	1 mg/mL in H2O
2% Formaldehyde		Sigma-Aldrich	F1268
RNase A from bovine pancreas		Sigma-Aldrich	R4642
DRAQ5		Biostatus	DR50050	Dilute 1:60 in 1 x PBS-/-