Измененный Аннексин В / пропидия йодидом Апоптоз Пробирной для точной оценки клеточной смерти

Резюме

Точным методом оценки гибели клеток описывается. Протокол улучшает обычных Аннексин В / пропидий йодида (PI) протоколов, которые отображают до 40% ложно-положительных событий в клеточных линий и первичных клеток от широкого круга животных моделях.

Аннотация

Исследования клеточного апоптоза было существенное влияние с момента появления проточной цитометрии основе методов. Пропидий йодида (PI) широко используется в сочетании с Аннексин V, чтобы определить, клетки жизнеспособны, апоптоза, или некротических через различия в плазме целостность мембраны и проницаемость ^1,2. Аннексин V / PI протокол широко используется подход к изучению апоптоза клеток ^3. П. И. используется чаще, чем у других ядерных пятна, потому что это экономично, стабильный и хороший показатель жизнеспособности клеток, основанный на его способности, чтобы исключить красителя в живых клетках ^4,5. Способность П. И. войти клеток зависит от проницаемости мембраны; PI не окрашивает жить или в начале апоптоза клеток из-за присутствия нетронутыми плазматической мембраны ^1,2,6. В конце апоптоза и некроза клеток, целостность плазмы и ядерной мембраны уменьшается ^7,8, что позволяет PI проходить через мембраны, интеркалировать в нуклеиновые кислоты, а также отображать красной флуоресценции ^1,2,9. К сожалению, мы обнаружили, что обычные Аннексин V / PI протоколов привести к значительным числом ложных положительных событий (до 40%), которые связаны с П. И. окрашивания РНК в цитоплазматических отсека ^10. Первичные элементы и клеточных линий в широком диапазоне моделей на животных затронуты, с крупными ячейками (ядерное топливо: цитоплазматические отношения <0,5), демонстрирующий высшую возникновения ^10. При этом, мы демонстрируем изменение Аннексин V / PI метод, который обеспечивает значительное улучшение оценки гибели клеток по сравнению с обычными методами. Этот протокол использует изменения в клеточной проницаемости в процессе клеточного крепления к содействию вступления РНКазы в клетки следующие окрашивания. Оба времени и концентрации РНКазы были оптимизированы для удаления цитоплазматической РНК. Результатом является значительное улучшение по сравнению с обычными Аннексин V / PI протоколов (<5% событий с окрашиванием цитоплазмы PI).

протокол

Эта процедура может быть выполнена в 500 мкл силиконовая трубки или 6 мл полистирола с круглым дном FACS труб. Последний обычно используется при проведении анализа жизнеспособности в сочетании с другими процедурами. Все объемы указаны только для 6 мл полистирола с круглым дном FACS труб. Для 500 мкл силиконовая трубки, свести все объемы на 1 / 5.

Оптимальная концентрация для анализа потока цитометрии в 2-4 х 10 ^{6 клеток} на 200 мкл объема. Сотовые потери могут возникнуть в результате этой процедуры, и таким образом, мы рекомендуем, чтобы каждый образец состоит из 4 х 10 ^{6 клеток} в начале процедуры.

1. Сотовые подготовка

1. Урожай клеток - ссылаться на конкретные процедуры для соответствующих клеточных линий или первичного выделения клеток.
2. Центрифуга образцов при 335 х г в течение 10 минут и сцедить супернатант.
3. Ресуспендируют клеток в 2 мл 1 фосфат х солевым буфером (PBS) ^{- / -} (без кальция, магния нет).
4. Центрифуга образцов при 335 х г в течение 10 минут и сцедить супернатант.
5. Ресуспендируют клеток в 1 мл 1 х Аннексин V буфера для связывания.
6. Центрифуга образцов при 335 х г в течение 10 минут и сцедить супернатант.
7. Ресуспендируют клеток в 100 мкл 1 х Аннексин V буфера для связывания.

2. Применение Аннексин V / PI пятно

1. Добавить Аннексин V в соответствии с рекомендациями производителя [например, 5 мкл Аннексин V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)].
2. Инкубируйте труб в темноте в течение 15 минут при комнатной температуре.
3. Добавить 100 мкл 1 х Аннексин V обязательным буфер для каждой реакции трубки. Там должно быть около 200 мкл в каждую пробирку.
4. Добавьте 4 мкл PI (Sigma, кат № Р-4864-10 мл), который был разбавленным 1:10 в 1 х Аннексин V связывающем буфере (т.е. 1 мкл PI с 9 мкл 1 х Аннексин V буфера для связывания). Это приведет к окончательной концентрации PI 2 мкг / мл в каждом образце.
5. Инкубируйте труб в темноте в течение 15 минут при комнатной температуре.
6. Добавить 500 мкл 1 х Аннексин V буфера для связывания мыть клетки.
7. Центрифуга образцов при 335 х г в течение 10 минут и сцедить супернатант.
8. Ресуспендируют клеток в 500 мкл 1 х Аннексин V буфера для связывания и 500 мкл 2% формальдегида для создания 1% формальдегида (фиксатором) решение. Смешайте трубы, осторожно стряхивая.
9. Fix образцы на льду в течение 10 минут. Кроме того, образцы могут храниться в течение ночи при 4 ° С в темноте. Если последний метод был выбран, удостоверьтесь, чтобы быть последовательным во всех трубах помечены Аннексин V / PI (в том числе компенсации управления).
10. Добавьте 1 мл 1 х PBS ^{- / -} для каждого образца и аккуратно перемешать, щелкая.
11. Пробирки центрифужные в 425 х г в течение восьми минут и сцедить супернатант.
12. Повторите шаги с 2.10 и 2.11.
13. Ресуспендируют гранул, щелкая трубки.
14. Добавить 16 мкл разбавленной 1:100 РНКазы (Sigma, R4642), чтобы дать конечной концентрации 50 мкг / мл. Инкубировать 15 минут при температуре 37 ° C.
15. Добавьте 1 мл 1 х PBS ^{- / -} и аккуратно перемешать, щелкая.
16. Пробирки центрифужные в 425 х г в течение восьми минут.
17. Образцы теперь готовы для анализа. Кроме того, образцы можно использовать для последующих шагов, если окрашивание Аннексин / PI окрашивание выполняется параллельно с другими процедурами.

3. Представитель Результаты:

Примеры типов клеток и клеточных линий, которые имеют различные степени ложно-положительных П. И. окрашивания показаны на рисунке 1. Для учета ложно-положительных событий, клетки фиксируют, а затем обрабатывают РНКазы А. Это приводит к значительному уменьшению количества ложно-положительных событий, по сравнению с клетками, которые не прошли РНКазы лечения (рис. 2В). Рис 2С показывает, представитель изображений клеток, подвергшихся РНКазы лечения, по сравнению с клетками, которые не имеют лечения РНКазы. Рисунок 3 показывает, как изменение Аннексин V / PI протокол, с фиксацией и шаги РНКазы лечения, улучшает обычные протоколы, ограничивая число ложно-положительных событий окрашивания.

Рисунок 1. Обычные протоколы йодида пропидий окрашивания привести к значительным числом ложных положительных событий. Ранее мы оценивали степень ложноположительных окрашиванию через первичные элементы в широком диапазоне моделей на животных, а также в различных клеточных линиях ^10. Представитель изображения показывают степень ложных срабатываний окрашивания в три уникальные клеточные популяции (обычно используются клеточные линии - RAW макрофагов и два первичных клеток - костного мозга мышиных макрофагов (БММ) и золотая рыбка первичной макрофагов почек (ПКМ)). Правда позитивных событий дисплей ожидается совместное локализации между ИП и DRAQ5 в ядерном отсеке (желтые области изображают колокализации между ИП и DRAQ5). DRAQ5 очень membraпе проницаемой краситель, который точно пятна ядерной отсеке и в живых и мертвых клеток ^10,11,12. Для облегчения визуального определения колокализации DRAQ5 пятна был дан зеленый pseudocolour.

Рисунок 2. Более точное значение PI окрашивание ядер. () Мы оценили точность П. И. окрашивание ядер в зависимости от степени сходства ряда хорошо известных ядерных пятна (BrdU, 7-AAD и DAPI), чтобы DRAQ5. BrdU представляет собой синтетический нуклеозид, которая включена в ДНК пролиферирующих клеток, и как таковая будет только пятно в ядерном отсеке. 7-AAD имеет высокое сродство к ДНК и, как и ИП, не может пересечь нетронутыми плазматической мембране. DAPI также имеет сильное сродство к ДНК и является наиболее часто используемых ядерных пятном в люминесцентной микроскопии. Степень сходства было> 99% в период с BrdU, 7-AAD, DAPI и DRAQ5, выделяя их способность точно пятно клеточного ядра в RAW 264,7 макрофагов. В отличие от цитоплазматического окрашивания П. И. на основе традиционных протоколов приводит к заметному снижению процента сходство окраски по отношению к DRAQ5. (Б) Подобные результаты наблюдаются в двух первичных элементов протестированы: мышиных макрофагов костного мозга (БММ) и золотая рыбка первичной макрофагов почек (ПКМ). Включение 50 мкг / мл РНКазы на определенном этапе в течение окрашивания процедура удаляет неядерных П. И. окрашивания и значительно увеличивает степень сходства по отношению к DRAQ5 окрашивания. (C) представитель образы первичных макрофагов почек показать степень сходства для клеток с и без лечения РНКазы. Для облегчения визуального определения различия между процедурами, DRAQ5 был дан зеленый. Желтый областях изображают колокализации между BrdU и DRAQ5, П. И. и DRAQ5.

Рисунок 3. Измененный Аннексин V / PI значительно снижает ложные апоптоз / некротические события. Первичная золотая рыбка почек макрофагов (ПКМ) были окрашены обычной и модифицированной Аннексин V / PI протоколов. Диаграммы рассеяния изобразить Аннексин V / PI пятна в золотой рыбки ПКМ. Рассеяния слева показывает обычные Аннексин V / PI окрашивания (без РНКазы) из ПКМ клеток. Рассеяния справа показывает ПКМ клеток, окрашенных изменение Аннексин V / PI протокол (с РНКазы). Помимо результатов РНКазы в выраженное снижение PI окрашивания из-за удаления ложных положительных пятен. ПКМ клетки были затем проанализированы на основе различных групп населения в рамках культур-предшественников ранней (EP), моноцитов (моно) и зрелых макрофагов (Мат Mac). Сокращение числа позитивных событий П.И., из-за удаления ложных положительных событий является более выраженным в крупных зрелых клеток макрофагов, чем в небольших ранних клеток-предшественников. Выводы, основанные на традиционных протоколов бы ошибочно предложил положительную корреляцию в клеточной смерти для более зрелых подмножества макрофагов.

Обсуждение

Аннексин V / PI протокол, представленные здесь, модифицированной версией обычных протоколов и принимает во внимание наличие РНК в цитоплазме, которая также имеет высокое сродство к PI. Внедрение РНКазы (50 мкг / мл) после шага 1% формальдегида фиксации в конце процедуры окрашивания значительно улучшает точность ядерное окрашивание PI. Каких-либо негативных эффектов наблюдается в ядерных окрашивания ИП или плазматической мембраны Аннексин V окрашивания. Без РНКазы лечения, до 40% от PI пятно результаты могут привести к ложным положительным событиям, что приводит к потенциально значительные и негативное влияние на течение выводы ^10.

Наши изменение Аннексин V / PI окрашивания протокол является простым и эффективно используется в широком диапазоне типов клеток (Первичные элементы: мышиные костного мозга макрофагами и спленоцитов; свиной клетки резидент легких, альвеолярных макрофагов легких, мезентериальных лимфатических узлов изоляты, лейкоцитов периферической крови , спленоцитов, клетки куриного бластодерма; золотая рыбка первичной макрофагов почек; карп лейкоцитов периферической крови; Клеточные линии: RAW 264,7 макрофагов, Т-клетки Jurkat, свиней 3D4/31 макрофаги, CCL-71 фибробласты золотые рыбки плавник, 3B11 сома В-клетки ^10). Важно отметить, что клетки дифференциально пострадавших от ложных срабатываний окрашивания П.И., с первичной клетки в целом, имеющие большее количество ложных положительных событий ^10. Различия ложноположительных окрашиванию PI среди этих клеточных популяций может быть частично связано с различиями в размер ячейки, но может также возникнуть в результате различий в содержании РНК. Таким образом, включение эта процедура особенно актуальна для экспериментальных систем, которые используют, в частности, клетки проходят генотоксического стресса, клетки, обработанные клеточного цикла препараты, такие как тимидина или гидроксимочевины, вирусно-инфицированные клетки, а также исследования на эмбриональных клетках, где развитие прогрессии характеризуется дискретные изменения в клеточном синтезе РНК.

Материалы

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
1 x PBS-/-
1 x Annexin V Binding Buffer		BD Biosciences	556454
Annexin V-Alexa Fluor 488		Molecular Probes (Invitrogen)	A13201
Propidium iodide (PI)		Sigma-Aldrich	P4864	1 mg/mL in H2O
2% Formaldehyde		Sigma-Aldrich	F1268
RNase A from bovine pancreas		Sigma-Aldrich	R4642
DRAQ5		Biostatus	DR50050	Dilute 1:60 in 1 x PBS-/-