השתנה Annexin V / Propidium אפופטוזיס יודיד Assay לקבלת הערכה מדויקת של מוות של תאים

Summary

שיטה מדויקת להערכת מוות של תאים מתואר. פרוטוקול משפר עם קונבנציונאלי Annexin V / propidium (PI) פרוטוקולים יודיד, אשר להציג עד חיוביות שגויות אירועי 40% בשורות תאים תאים ראשוניים מתוך מגוון רחב של מודלים של בעלי חיים.

Abstract

מחקרים של אפופטוזיס הסלולר כבר מושפע באופן משמעותי מאז כניסתה של cytometry שיטות מבוססות זרימה. יודיד Propidium (PI) נעשה שימוש נרחב בשיתוף עם Annexin V כדי לקבוע אם התאים קיימא, אפופטוטיים, נמקי או באמצעות ההבדלים שלמות קרום פלזמה ו ^1,2 חדירות. V / PI Annexin פרוטוקול היא גישה הנפוץ לחקר תאים אפופטוטיים ^3. PI משמש לעתים קרובות יותר מאשר כתמים גרעיני אחרים כי זה חסכוני, יציבה אינדיקטור טוב של כדאיות התא, המבוססת על יכולתה להוציא לצבוע בתאים חיים ^4,5. היכולת של PI לחדור לתא תלויה החדירות של הממברנה; לצרכן לא להכתים תאים אפופטוטיים לחיות או מוקדם בשל נוכחותם של קרום פלזמה שלם ^1,2,6. בשנת תאים אפופטוטיים, נמקי מאוחר, את שלמות פלזמה ו ממברנות הגרעין פוחתת ^7,8, המאפשר לצרכן לעבור דרך הממברנות, intercalate לתוך חומצות גרעין, ולהציג אדום פלואורסצנטי ^1,2,9. למרבה הצער, אנו מוצאים כי קונבנציונאלי Annexin V / PI פרוטוקולים להביא מספר משמעותי של אירועים חיובי כוזב (עד 40%), אשר משויכים מכתים לצרכן של RNA בתוך תא cytoplasmic ^10. תאים ראשוניים שורות תאים במגוון רחב של מודלים של בעלי חיים מושפעים, עם תאים גדולים (הגרעין: יחסי cytoplasmic <0.5) מראה את המופע הגבוהה ביותר ^10. בזאת, אנחנו מדגימים שונה Annexin V / PI שיטה המספקת שיפור משמעותי להערכה של מוות של תאים בהשוואה לשיטות קונבנציונליות. פרוטוקול זה מנצל שינויים בחדירות התא הסלולרי במהלך תיקון כדי לקדם את כניסתם של RNase לתאים הבאים מכתים. גם עיתוי וריכוז RNase מוטבו להסרת RNA cytoplasmic. התוצאה היא שיפור משמעותי לעומת המקובל Annexin V / פרוטוקולי PI (<5% עם אירועים מכתים cytoplasmic PI).

Protocol

הליך זה יכול להתבצע 500 צינורות siliconized μL או 6 פוליסטירן מ"ל מסביב לתחתית צינורות FACS. האחרון משמש בדרך כלל בעת ביצוע ניתוח הכדאיות יחד עם הליכים אחרים. כל הכרכים נתון במשך 6 פוליסטירן מ"ל מסביב לתחתית צינורות FACS. במשך 500 צינורות siliconized μL, לצמצם את כל הכרכים של 1 / 5.

הריכוז האופטימלי עבור ניתוח cytometry זרימה הוא 2-4 x 10 ⁶ תאים לכל נפח 200 μL. אובדן תאים עשויים לנבוע הליך זה ובכך אנו ממליצים מדגם זה מורכב 4 x 10 ⁶ תאים בתחילת ההליך.

1. תא הכנה

1. תאים קציר - מתייחסים להליכים מיוחדים שורות תאים המתאימים או isolations התא הראשוני.
2. צנטריפוגה דגימות x 335 גרם במשך 10 דקות למזוג supernatant.
3. תאים Resuspend ב 2 פוספט x 1 מ"ל בופר סליין (PBS) ^{- / -} (לא סידן, מגנזיום, לא).
4. צנטריפוגה דגימות x 335 גרם במשך 10 דקות למזוג supernatant.
5. Resuspend תאים 1 מ"ל 1 חיץ x V Annexin מחייב.
6. צנטריפוגה דגימות x 335 גרם במשך 10 דקות למזוג supernatant.
7. תאים Resuspend ב 100 חיץ μL 1 x V Annexin מחייב.

2. יישום Annexin V / PI כתמים

1. הוסף Annexin V לפי ההמלצות של היצרן [למשל 5 μL Annexin V אלקסה פלואוריד 488 (בדיקות מולקולריות, A13201)].
2. דגירה צינורות בחושך במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
3. הוספת 100 μL של 1 חיץ x V Annexin מחייב צינור כל תגובה. לא צריך להיות כ 200 μL בצינור אחד.
4. הוסף 4 μL של PI (Sigma, חתול # P-4864-10 מ"ל) כי כבר מדוללת 1:10 ב 1 חיץ x V Annexin מחייב (כלומר 1 PI μL עם 9 1 μL חיץ x V Annexin מחייב). זו תניב ריכוז לצרכן הסופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​במדגם אחד.
5. דגירה צינורות בחושך במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
6. הוספת 500 μL 1 x Annexin חיץ V מחייב לשטוף את התאים.
7. צנטריפוגה דגימות x 335 גרם במשך 10 דקות למזוג supernatant.
8. תאים Resuspend ב 500 1 μL חיץ x V Annexin מחייב 500 פורמלדהיד 2% μL כדי ליצור פתרון 1% פורמלדהיד (מיצב). מערבבים צינורות ידי מצליף עדין.
9. תקן דגימות קרח במשך 10 דקות. לחלופין, ניתן לאחסן דגימות לילה ב 4 ° C בחושך. אם שיטת האחרון נבחר, הקפד להיות עקבי לאורך כל הצינורות שכותרתו עם Annexin V / לצרכן (כולל בקרות פיצוי).
10. הוסף 1 מ"ל 1 x PBS ^{- / -} לדגום כל ומערבבים בעדינות על ידי מצליף.
11. צנטריפוגה צינורות ב 425 x גרם במשך שמונה דקות למזוג supernatant.
12. חזור על שלבים 2.10 ו - 2.11.
13. Resuspend גלולה ידי מצליף את הצינורית.
14. הוסף 16 μL של 1:100 בדילול RNase (Sigma, R4642) לתת הריכוז הסופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל. דגירה של 15 דקות בשעה 37 ° C.
15. הוסף 1 מ"ל 1 x PBS ^{- / -} ומערבבים בעדינות על ידי מצליף.
16. צנטריפוגה צינורות ב 425 x גרם במשך שמונה דקות.
17. דוגמאות מוכנים כעת להיות מנותח. לחלופין, דגימות יכול לשמש הצעדים הבאים מכתים אם Annexin / PI מכתים מתבצע במקביל הליכים אחרים.

3. נציג תוצאות:

דוגמאות של סוגי תאים שורות תאים בעלי דרגות שונות של צביעה חיוביות שגויות לצרכן מוצגות באיור 1. כדי להסביר את חיוביות שגויות אירועים, תאים תוקנו וטופלו לאחר מכן עם RNase A. התוצאה היא ירידה משמעותית במספר אירועי חיוביות שגויות, לעומת תאים שלא עברו טיפול RNase (תרשים 2B). איור 2C מראה תמונות נציג של תאים שעברו טיפול RNase, לעומת תאים לא היה טיפול RNase. איור 3 מראה כיצד Annexin שונה V / PI פרוטוקול, עם קיבעון צעדים RNase הטיפול, משפר עם פרוטוקולי קונבנציונלי על ידי הגבלת מספר חיוביות שגויות אירועים מכתים.

באיור 1. קונבנציונלי יודיד propidium פרוטוקולים מכתים להביא מספר משמעותי של אירועים חיובי כוזב. יש לנו הערכה בעבר מידת מכתים חיובי כוזב על פני תאים ראשוניים במגוון רחב של מודלים של בעלי חיים כמו גם במגוון רחב של שורות תאים ^10. נציג להראות תמונות היקף מכתים חיובי כוזב בשלוש אוכלוסיות תאים ייחודיים (קו אחד התא הנפוץ - מקרופאגים RAW ושני תאים ראשוניים - Murine מח עצם מקרופאגים (BMM) ו העיקרית דגי זהב כליה מקרופאגים (PKM)). אירועים חיוביים אמנם צפוי להציג את שיתוף לוקליזציה בין PI ו DRAQ5 בתוך תא גרעיני (אזורים צהובים מתארים colocalization בין PI ו DRAQ5). DRAQ5 הוא membra מאודנה חדיר כתמי צבע במדויק תא גרעיני הן תאים חיים ומתים ^10,11,12. לקביעת ויזואלי קל של colocalization DRAQ5 כתם קיבל pseudocolour ירוק.

איור 2. שיפור הדיוק של מכתים לצרכן גרעיני. (א) בחנו הדיוק של מכתים לצרכן גרעיני המבוסס על מידת הדמיון של מספר היטב המאופיינת בכתמים גרעיני (BrdU, 7-AAD ו DAPI) כדי DRAQ5. BrdU הוא nucleoside סינתטי משולב אל תוך הדנ"א של התאים מתרבים, וככזה יהיה רק ​​כתם בתוך תא גרעיני. 7-AAD יש זיקה גבוהה עבור דנ"א, בדומה לצרכן, לא יכול לעבור ללא פגע הממברנה הפלסמטית. DAPI יש גם זיקה חזקה דנ"א הוא הגרעין הנפוץ ביותר כתם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מידת הדמיון היה> 99% בין BrdU, 7-AAD, DAPI ו DRAQ5, המדגיש את יכולתם במדויק כתם לגרעין התא ב 264.7 מקרופאגים RAW. לעומת זאת, מכתים לצרכן cytoplasmic מבוסס על פרוטוקולים קונבנציונאלי מוביל להפחתה ניכרת של דמיון אחוז מכתים יחסית DRAQ5. (ב) תוצאות דומות נצפו בשני תאים ראשוניים נבדק: Murine מח עצם מקרופאגים (BMM) ו העיקרית דגי זהב כליה מקרופאגים (PKM). התאגדות של 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​RNase בשלב מסוים בתוך ההליך מסיר כתמים ללא גרעיני מכתים PI ו מגביר באופן משמעותי את מידת הדמיון ביחס מכתים DRAQ5. (ג) נציג תמונות של מקרופאגים כליה העיקרי להראות את מידת הדמיון של תאים עם או בלי טיפול RNase. לקביעת ויזואלי קל יותר של ההבדלים בין הטיפולים, DRAQ5 ניתנה ירוק. אזורים צהוב מתארים colocalization בין BrdU ו DRAQ5 ו PI ו DRAQ5.

איור 3. השתנה Annexin V / PI מפחית באופן משמעותי אפופטוזיס שווא / אירועים נמקי. ראשי כליה דגי זהב מקרופאגים (PKM) הוכתמו קונבנציונאלי שונה Annexin V / PI פרוטוקולים. Scatterplots לתאר את V Annexin / PI כתם PKM דגי זהב. Scatterplot משמאל מראה קונבנציונאלי Annexin V / PI מכתים (אין RNase) של תאים PKM. Scatterplot בצד ימין מראה תאים PKM מוכתמות Annexin שונה V / פרוטוקול PI (עם RNase). תוספת של תוצאות RNase לירידה הניכרת של מכתים לצרכן עקב הסרת כתמים חיובי כוזב. תאים PKM היו אז ניתחו מבוסס על אוכלוסיות שונות בתוך תרבויות מוקדמת אבות (EP), מונוציטים (מונו) ומקרופגים בוגרת (מאט מק). הירידה במספר האירועים החיוביים לצרכן, בשל הסרת אירועים חיוביים כוזבים הינה בולטת יותר גדול תאים macrophage בוגרת מאשר קטן ובתאים המוקדמות. מסקנות מבוסס על פרוטוקולים קונבנציונלי היה מציע בטעות מתאם חיובי במוות הסלולר עבור תת macrophage יותר בוגרת.

Discussion

V Annexin / PI פרוטוקול המוצג כאן הוא גרסה שונה של פרוטוקולים קונבנציונאלי לוקח בחשבון את נוכחותם של רנ"א בציטופלסמה שיש לה גם זיקה גבוהה עבור לצרכן. מבוא של RNase (50 מיקרוגרם / מ"ל) לאחר שלב 1% פורמלדהיד קיבעון מאוחר בהליך מכתים משפר משמעותית את הדיוק של מכתים לצרכן גרעיני. השפעות שליליות הן לא נצפתה מכתים לצרכן גרעיני או פלזמה קרום מכתים Annexin V. ללא טיפול RNase, עד 40% של תוצאות PI כתם יכול להוביל לאירועים חיובי כוזב, אשר מוביל השפעה משמעותית פוטנציאל שלילי על מסקנות במורד ^10.

שונה שלנו Annexin V / PI פרוטוקול מכתים הוא פשוט נעשה שימוש יעיל במגוון רחב של סוגי תאים (תאים ראשוניים: Murine מח עצם מאקרופאגים splenocytes; החזירים תושב לתאי ריאה, מקרופאגים ריאות מכתשיים, mesenteric צומת מבודד הלימפה, leukocytes דם היקפיים , splenocytes; blastoderm תאים עוף, דג זהב העיקרי מקרופאגים כליה; leukocytes קרפיון דם היקפיים; קווי נייד: RAW 264.7 מקרופאגים, Jurkat בתאי T, החזירים 3D4/31 מקרופאגים, CCL-71 fibroblasts סנפיר דג, שפמנון 3B11 B תאים ^10). חשוב לציין כי התאים מושפעים באופן דיפרנציאלי על ידי מכתים שווא לצרכן חיובית, עם תאים ראשוניים בדרך כלל לאחר מספר גדול יותר של אירועים חיובי כוזב ^10. ההבדלים לצרכן שווא מכתים חיובית בקרב אוכלוסיות אלה הסלולר ניתן לייחס בחלקו ההבדלים בגודל התא, אך יכול גם לנבוע הבדלים בתוכן RNA. כמו שילוב כזה, של הליך זה רלוונטי במיוחד עבור מערכות ניסיוניות לנצל, בין היתר, התאים העוברים מתח genotoxic, בתאים שטופלו מחזור התא תרופות כגון מעצר או thymidine hydroxyurea, תאים נגועים בנגיף, מחקרים על תאים עובריים שבהם התקדמות התפתחותית מאופיין על ידי שינויים בדידים בסינתזה RNA התאי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 x PBS-/-
1 x Annexin V Binding Buffer	BD Biosciences	556454
Annexin V-Alexa Fluor 488	Molecular Probes, Life Technologies	A13201
Propidium iodide (PI)	Sigma-Aldrich	P4864	1 mg/mL in H2O
2% Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F1268
RNase A from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	R4642
DRAQ5	Biostatus	DR50050	Dilute 1:60 in 1 x PBS-/-