在完整的感觉器官前体细胞的活细胞成像果蝇蛹

摘要

在这段视频中，我们描述了完好的感觉器官祖细胞和表皮细胞不对称分裂的活细胞成像的方法果蝇蛹

摘要

绿色荧光蛋白（GFP）的发现以来，一直存在着革命性的变化作为理解基本的生物机制工具使用中的活细胞成像。显着进展表现得尤为明显， 在果蝇的突变体和转基因株系，其广泛的工具包提供了一个方便的模型来研究发育和细胞生物学机制的进化保守。我们有兴趣了解的机制，成人外周血在果蝇的神经系统（PNS）的控制细胞命运规范 。鬃，包括头部，胸部，腹部，腿部和成人飞的翅膀个别mechanosensory机关，并已研究为了解一流的依赖细胞命运的决定的机制的模型系统。感觉器官易制毒化学（专科）的microchaetes（或小刷毛）的细胞，是分布在整个蛹胸部的上皮细胞，并在pupariation发病后12小时指定。规范后，SOP的细胞开始分裂，分离麻木，在有丝分裂过程中的一个子细胞的细胞命运的决定因素。 Notch信号通路作为细胞自治抑制剂麻木的功能。

在这里，我们表现出遵循的完整的蛹胸部内的蛋白质动力学的SOP细胞和它的后代的使用结合的方法组织特定的Gal4的司机和^GFP标记的融合蛋白1,2。这项技术在固定组织或培养的优势外植体，因为它允许我们遵循整个开发的终端器官的生长和分化的神经前体规格器官。因此，我们可以直接关联细胞行为的变化，在终末分化的变化。此外，我们还可以与repressible细胞标记（MARCM）系统的实时成像技术结合起来，以评估在有丝分裂的SOP标签蛋白突变或野生型条件下的动态马赛克分析。使用这种技术，我们和其他人透露不对称细胞分裂的调节和控制（例子包括^{引用1-6,7，8）}的SOP细胞活化的Notch信号，新的见解。

研究方案

所需材料：解剖立体显微镜，双面胶带，标准显微镜载玻片和盖玻片，解剖钳（大小为5或5.5），软毛刷，硅真空润滑脂，注射器5CC的Whatman纸，共聚焦或epifluorescence显微镜与数码相机和图像采集软件。

1。蛹夹层

1. 设置跨（使用适当的组合Gal4的线和一个GFP标记的无人机控制下的融合蛋白）或地方苍蝇从一个股票你想在几个新鲜瓶的形象，在25 ° C。
2. 的SOP细胞开始增殖蛹胸部pupariation发病后18个小时，因此，我们选择适当的飞股票或交叉的“白”从蛹。白蛹蛹的形态，但有一个unpigmented蛹的情况下，这表明，在一小时内pupariated。
3. 等待约18小时。
4. 幻灯片上放置了一块双面胶带。收集蛹和蛹的情况下与腹侧方坚持下来双面胶带。把握镊子鳃盖边缘（前蛹的情况下背尖圆形舱口）
5. 轻轻抬起，删除，并丢弃的鳃盖，露出不成熟的飞行团长。
6. 使用镊子开始蛹的情况下沿一侧撕裂。电梯从蛹的情况下腹部撕裂方，并把它交给另一侧，或者删除它完全或将它附加到磁带，露出胸部和腹部前部。 （注意：：有发展中的飞行和蛹的情况之间的差距。要小心不要穿刺飞墙的情况下被撕裂。）
7. 蛹的情况下朝后结束的同一侧沿开始切割。再次，要注意不要穿刺飞。蛹的情况下，拉飞的对面，然后按它的双面胶带上。现在应该充分暴露腹部。将直接飞头下方的软毛刷。一旦飞被卡住刷和蛹的情况下自由，用刷子轻轻关闭幻灯片飞。

2。蛹安装

解剖后，蛹，然后安装幻灯片和盖玻片之间：

8. 隔离蛹的情况下删除，然后可以放在玻片背侧中心。
9. 制作的Whatman纸18X18mm的方形镜框，在中间留下一个10X10毫米开放。沉浸在水中的纸张，直到饱和。广场周围的蛹。
10. 使用5毫升注射器充满硅真空润滑脂，适用于周围的Whatman帧一层均匀的油脂。油脂层应该适合于盖玻片（图1），厚度应只比蛹直径更大。
11. 放置在一个22x22毫米盖玻片中心的一个小水滴（1μL）和盖玻片放在上面的准备，这样的小水滴接触表面上你想要的形象，在这种情况下notum）。轻轻地压缩，形成一个完全密封的真空润滑脂和平坦的接触面之间的盖玻片和蛹角质层。
12. 准备就可以进行成像倒置或直立microcopes，使用或者epifluorecence，焦（激光扫描或旋转的磁盘类型）或双光子共焦。如果你细心，成蝇，可以在几天后恢复。

3。代表性的成果：

使用一个特定的SOP - GAL4线（ neuralized Gal4的）划线，以绿色荧光蛋白标签蛋白标签的有丝分裂纺锤体（微管蛋白或头GFP）或组蛋白（H2B - GFP），人们可以观察到飞机师的SOP细胞分裂，细胞周期的长度，或有丝分裂的数目部门所使用时间的推移成像 ⁹。其他目标，如RAB - GTP酶的细胞器，以纪念不同吞车厢（早期Rab5 - GFP融合蛋白内涵体或供循环再造的Rab11 GFP的内涵体）或蛋白质Notch信号调节（麻木，麻木的GFP，或Sanpodo合伙人的重要- GFP），可以产生不对称细胞分裂的机制和膜蛋白贩运的重要见解 ^2,3,7,10,11。

图1：蛹清扫和安装。 A。步骤一步的图像显示的程序，删除蛹的情况下安装和活细胞成像，并准备完整的蛹。蛹从小瓶放在背侧载玻片双节棍磁带。第一列，去除鳃盖和蛹的情况下沿一侧撕裂。第二列从胸部和腹部地区，蛹的情况下去除。免费蛹，然后解除从蛹的情况下使用软毛刷。 B。安装幻灯片和盖玻片之间的蛹。蛹背端放置载玻片上，四周由的Whatman纸蘸框架。一个连续挤压5CC针筒职能有机硅真空润滑脂珠密封的滑动盖玻片组合，dessication蛹保护和提升盖玻片，所以它由蛹胸部轻轻。使用浸泡目标（水或油）时，一个水盖玻片和胸部角质层之间的接口（1μL）的小水滴，显着提高了图像质量。点击这里查看大图。

图2：生活的SOP细胞和外部使用我们的蛹清扫和安装程序，采取有区别的感觉器官的代表图像。一。从有丝分裂的SOP细胞的时间控制下的肌动蛋白- GFP融合蛋白表达的系列提取图像 neuralized： Gal4的（ neur Gal4/UAS-actin-GFP），请注意皮质肌动蛋白的积累，在分裂沟（1张/每2分钟）。 B。 SOP的女儿细胞共同表达麻木RFP（红色）的合作伙伴和Rab5 - GFP的驱动 neuralized： Gal4的，请注意一个女儿细胞（pIIb）和早期内涵体分布在两个子细胞中的PON - RFP的不对称分布。 C。在后期蛹期，采取有区别的外部感觉器官量呈现一个Z系列。角质层的结构，如mechnosensory，刷毛和表皮的头发角质层自体荧光（红色）显示。此外，我们已经使用了MARCM的系统，以表达LGL - GFP（驱动 neuralized： Gal4的感觉器官前体细胞（绿色）的一个子集）。 （这些图像均获得扫描共聚焦显微镜使用60X 1.45 NA目标使用尼康C1）

讨论

在这个视频中，我们说明了一种技术，用于隔离和安装果蝇 pupaefor蛹notum SOP细胞的活细胞成像。蛹蛹的情况下去除需要一个稳定的手，合适的工具，和一些练习，但很容易学习。蛹分期准确，以确保相对缓和的清扫和醒目的专科发展的扩散阶段，这一点很重要。一旦安装，蛹会继续发展幻灯片和盖玻片之间，在大多数情况下，将达到pharate成年阶段，并最终eclose。在我们的经验，电池可在几个小时的过程中成像。时这种安装技术不局限于观察蛹胸部PNS的前体细胞，但可用于可视化的任何细胞，接近表面角质层和显微镜物镜，（请注意，观察在一个阶段完成蛹的情况下，可以消除不杀蛹通常约10至14H puparium形成后）。我们有成功的可视化交界的蛋白质，细胞骨架蛋白蛹上皮细胞（未发表数据），囊泡运输监管。

蛹的安装技术也使我们能够发展在后期使用扫描共聚焦显微镜的蛹表皮结构图像的方法，以形象化的形态mechanosensory刷毛和使用内在自体荧光的角质层表皮毛发。飞角质层的扫描电子显微像这些图像，但可以从活畜收购，并允许我们同时看到表皮形态和表达绿色荧光 ^6,7,12。

材料