無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹

要約

このビデオでは、我々は非対称的に無傷で感覚器官の前駆細胞と表皮細胞を割っての生細胞イメージングのための方法を説明します。ショウジョウバエ蛹

要約

緑色蛍光タンパク質（GFP）の発見以来、基本的な生物学的メカニズムを理解するためのツールと​​してのライブセルイメージングの利用に革命的な変化があった。印象的な進歩は、その豊富なツールキット変異体とトランスジェニック系統のショウジョウバエ、で特に顕著されている進化的に保存の発達と細胞生物学的メカニズムを研究するのに便利なモデルを提供します。我々はショウジョウバエの成体末梢神経系（PNS）の制御の細胞運命の仕様は。カバー頭部、胸部、腹部、脚と成人のハエの羽は、個々のmechanosensory器官であることが剛毛、と検討されていることのメカニズムを理解することも検討されてノッチ依存性細胞の運命決定のメカニズムを理解するためのモデル系として。 microchaetes（または小の毛）の感覚器官の前駆体（SOP）細胞は、蛹の胸部の上皮に分布している、とpupariationの発症後の最初の12時間の間に指定されています。指定の後に、SOP細胞は有糸分裂中に1つの娘細胞へのNumbの細胞の運命決定因子を分離、分割し始める。 Notchシグナル伝達経路の細胞自律的阻害剤としての麻痺の機能。

ここで、我々は、組織特異的Gal4のドライバとGFP -タグ融合タンパク質の^1,2の組み合わせを使用して、そのまま蛹の胸郭内SOP細胞とその子孫に蛋白質のダイナミクスを追跡する方法を示しています。この手法は、固定組織上の利点や培養を持っている植それは、私たちは神経前駆体の仕様から成長し、臓器の分化への臓器の全体の開発を追跡することができるため。そこで、直接分化の変化に細胞挙動の変化を相関させることができます。さらに、変異体​​または野生型の条件下で有糸分裂のSOPでタグ付けされたタンパク質のダイナミクスを評価するために、抑制性細胞のマーカー（MARCM）システムでモザイク解析とライブイメージング技術を組み合わせることができます。このテクニックを使用して、我々と他の人は、非対称細胞分裂の調節およびSOPセル（例では、参照^1-6,7、8を含む）におけるNotchシグナル伝達活性化の制御に新たな洞察を明らかにした。

プロトコル

必要な材料：解剖のステレオ顕微鏡、両面テープ、標準的な顕微鏡スライドとカバースリップ、解剖の鉗子（サイズ5または5.5）、毛先が柔らかいブラシ、シリコン真空グリース、5cc注射器、ワットマン紙、デジタルカメラと画像との共焦点または落射蛍光顕微鏡収集ソフトウェア。

1。蛹の解剖

1. あなたが25℃、いくつかの新鮮なバイアルに画像を希望する株式℃から（Gal4のラインとUAS制御下にGFPタグ融合タンパク質の適切な組み合わせを使用して）クロスまたは場所のハエを設定する
2. SOP細胞は一般的にpupariationの発症後18時間で蛹の胸部に増殖を開始すると、我々は、したがって、適切なフライの株式やクロスから"白"蛹を選択します。白い蛹は蛹の形態を持っているが、それは時間内にpupariatedていることを示す、無着色の蛹のケースを持っている。
3. 約18時間を待ちます。
4. スライドの上に両面テープの一部を置きます。蛹収集し、下に腹側に両面テープに蛹のケースを付着する。鉗子で蓋の縁（蛹例前方背側先端に円形のハッチを）つかみ
5. 静かに、持ち上げて取り外し、蓋を捨てて、未熟なハエの頭部を明らかにする。
6. 蛹のケースの側面に沿って引き裂き始めるために鉗子を使用してください。引き裂かれた側から蛹の例中央部を持ち上げて反対側にそれを上に持って、どちらかを完全に削除するか、テープにそれを添付し、胸部と腹部の前方部分を明らかにし。 （（注）：開発フライと蛹のケースの間にすき間がある。穿刺にケースの壁のようなハエが引き裂かれしないように注意してください。）
7. 後端に向かって蛹の例と同じ側に沿って切断開始。もう一度、ない穿刺ハエに注意してください。ハエの反対側に蛹のケースを引いて、両面テープの上にそれを押してください。腹部は完全に公開する必要があります。直接ハエの頭の下に毛先が柔らかいブラシを置きます。フライは、ブラシと蛹の例自由に付着されると、静かにスライドオフフライを持ち上げるためにブラシを使用してください。

2。蛹の取り付け

解剖の後、蛹は、スライドとカバースリップの間に装着されています：

絶縁蛹はその後までスライドガラス背側の中央に配置することができます。
8. 途中で開いて10 × 10 mmを残してワットマン紙18X18mmの正方形のフレームを作成します。飽和するまで水に浸しますが紙。蛹の周りに置きます。
9. シリコン真空グリースを封入5ccのシリンジを使用して、ワットマンのフレームの周囲にグリースの均一な層を適用する。グリースの層がカバー内に収める必要があります（図1）と厚さは蛹の直径よりわずか少し大きくする必要があります。
10. 22X22 mmのカバースリップの中央に水の小滴（1μl）を配置し、上記の準備にカバースリップを配置するように小さな水滴の接触では、この場合は画像、胸背板にする面）。真空グリースとカバーガラスと蛹の表皮の間に平坦な接触面の完全なシールを形成するために軽く圧縮します。
11. 準備はしepifluorecence、共焦点（レーザーがディスクの種類をスキャンまたは回転）または2光子共焦点のいずれかを使用して、反転または直立microcopes上に結像することができます。あなたが慎重であれば、成人のハエが数日後に回収することができます。

3。代表的な結果：

SOP特有のGal4の行を（使用して neuralized - Gal4の）紡錘体（チューブリンまたはタウ- GFP）やヒストンタンパク質（H2B - GFP）をラベル付けするためにGFPタグ付きタンパク質に交差し、一部門のSOP細胞分裂の平面、細胞周期の長さ、または有糸分裂の数を観察することができますタイムラプスイメージングを使用して、部門 ⁹。 Notchシグナル伝達の調節（ナム-、ナム- GFP、またはSanpodoのパートナーに重要な役割を別のエンドサイトーシスの区画マークするなどのRab - GTPアーゼなどの細胞小器官を標的と他の融合タンパク質（早期のためのRab5の- GFPは、エンドソームやリサイクルのためのRab11がGFPは、エンドソーム）またはタンパク質- GFP）非対称細胞分裂と細胞膜のタンパク質輸送のメカニズムの重要な洞察をもたらすことができる ^2,3,7,10,11。

図1：蛹解剖と取り付け。 A.ステップごとに画像蛹のケースを取り外して、取り付けと生細胞イメージングのためにそのまま蛹を準備する手順を示しています。蛹には、スライドガラスに取り付けられたダブルスティックテープで、上バイアルから削除され、配置され、背側されています。最初の列、蓋の取り外しと蛹のケースの側面に沿って引き裂く。番目の列、胸部と腹部から蛹の例除去。裸蛹は、柔らかい毛先のブラシを使用して蛹のケースから持ち上げられる。 B.スライドとカバースリップの間で蛹を取り付け。蛹は、ワットマン濾紙の湿らせたフレームに囲まれ、ガラススライド上に背側を上に配置されます。 dessicationから蛹を保護し、それは蛹の胸部にゆっくりと休むようにカバースリップを昇降、スライドカバーの組み合わせを密封するために5ccシリンジの機能から押し出されたシリコン真空グリースの連続ビード。浸対物（水またはオイル）を使用するときにカバースリップと胸部のキューティクルの間の界面における水（1μL）の小滴は、大幅に画質を向上させます。拡大画像を表示するにはここをクリック。

図2：ライブSOP細胞と私たちの蛹の解剖と取り付けの手順を使用して撮影差別外部感覚器官の代表画像。 A。の制御下でアクチン- GFP融合タンパク質を発現する有糸分裂のSOPの細胞の時系列から抽出された画像 neuralized - Gal4の（ neuro -の異形 Gal4/UAS-actin-GFP）、（1画像/ 2分毎に）分裂溝でアクチンの皮質の蓄積に注意してください。 B。によって駆動されるナム- RFP（赤色）とRab5の- GFPの共発現パートナーSOPの娘細胞 neuralized - Gal4の、両方の娘細胞の1つの娘細胞（pIIb）とエンドソームの早期の配布にPON - RFPの非対称分布に注意してください。 C。 Zシリーズのボリュームレンダリングは遅く蛹の段階で差別化された外部の感覚器官の撮影。このようなmechnosensory毛や表皮毛などキューティクルの構造は、クチクラ自己蛍光（赤）によって明らかにされています。さらに、我々はLGL - GFPを（によって駆動される表現にMARCMシステムを使用しました neuralized - Gal4の）。 （これらの画像はすべて60X 1.45 NAの対物レンズを用いてニコンC1走査型共焦点顕微鏡を用いて取得された）

ディスカッション

このビデオでは、我々は分離してマウントするためのテクニックを示していますショウジョウバエ pupaefor蛹の胸背板上SOP細胞の生細胞イメージング。蛹のケースから蛹の除去は、着実に手、適切なツール、およびいくつかの練習が必要ですが、簡単に習得することができます。それは蛹のステージングは​​、解剖の相対的な容易さを確保し、SOP開発の増殖期をキャッチするためには、正確に行われることが重要です。一度マウントされている、蛹はスライドとカバースリップの間で発展していきます、そしてほとんどの場合、pharate大人の段階に達し、最終的に孵化する。我々の経験では、細胞が数時間にわたって撮像することができます。この実装技術は、（、蛹の胸部上PNSの前駆細胞の観察に限定されるものではなく、キューティクルの表面に近いと顕微鏡対物へのアクセス可能な任意の細胞を可視化するために使用することができます観察がステージで行われていることに注意してください。蛹のケース）は、通常約10〜14時間蛹殻の形成後、蛹を殺すことなく削除することができます。私たちは正常蛹の上皮細胞（未発表データ）で接合タンパク質、細胞骨格タンパク質と小胞輸送の規制当局を可視化した。

蛹の実装技術はまた、私たちはmechanosensory毛やキューティクルの本質的な自家蛍光を用いて表皮の毛の形態を視覚化するために走査型共焦点顕微鏡を用いた後期段階の蛹の画像クチクラ構造、する方法を開発することができました。これらのイメージは、ハエのクチクラの走査電子顕微鏡写真に似ていますが、生きている動物から取得することができる、と私たちは同時にクチクラの形態とGFP蛍光の発現を可視化することができます ^6,7,12。

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