Live-cellula Imaging di cellule sensoriali Precursore in Organo intatto Drosophila Pupae

Riepilogo

In questo video, si descrive un metodo per l'imaging cellulare dal vivo di dividere asimmetricamente sensoriale cellule progenitrici organo e cellule epidermiche in intatte Drosophila Pupe

Abstract

Dal momento che la scoperta di una proteina fluorescente verde (GFP), c'è stato un cambiamento rivoluzionario nell'uso di live-cell imaging come uno strumento fondamentale per la comprensione dei meccanismi biologici. Progresso clamoroso è stato particolarmente evidente in Drosophila, il cui vasto kit di strumenti di mutanti e linee transgeniche fornisce un modello utile per lo studio evolutivamente conservato meccanismi di sviluppo e delle cellule biologiche. Siamo interessati a capire i meccanismi che la cellula specifica di controllo destino nell'adulto sistema nervoso periferico (SNP) in Drosophila. Setole che coprono la testa, torace, addome, gambe e le ali della mosca adulti sono singoli organi mechanosensory, e sono stati studiati come sistema modello per la comprensione dei meccanismi delle decisioni cellulare Notch-dipendente destino. Organo sensoriale precursore (SOP), le cellule del microchaetes (o piccole setole), sono distribuiti in tutto l'epitelio del torace pupa, e sono specificati nelle prime 12 ore dopo l'insorgenza della pupariation. Dopo le specifiche, le cellule cominciano a dividersi SOP, segregare il determinante il destino della cellula Numb ad una cellula figlia durante la mitosi. Numb funzioni come una cellula autonoma-inibitore della via di segnalazione Notch.

Qui mostriamo un metodo per seguire la dinamica delle proteine ​​in cellule SOP e la sua progenie all'interno del torace intatto pupa utilizzando una combinazione di tessuto-specifici GAL4 driver e GFP-tagged ^1,2 fusione proteine. Questa tecnica ha il vantaggio rispetto tessuto fisso o coltivate espianti perché ci permette di seguire l'intero sviluppo di un organo da specifica del precursore neurale alla crescita e differenziazione terminale dell'organo. Possiamo quindi direttamente correlare i cambiamenti nel comportamento delle cellule ai cambiamenti nella differenziazione terminale. Inoltre, siamo in grado di combinare la tecnica di imaging dal vivo con l'analisi di mosaico con un marker delle cellule reprimibile (MARCM) sistema per valutare la dinamica delle proteine ​​taggato in SOP mitotico in condizioni mutante o di tipo selvatico. Utilizzando questa tecnica, noi e altri hanno messo in luce intuizioni romanzo in regolazione della divisione cellulare asimmetrica e il controllo di attivazione del segnale di Notch nelle cellule SOP (esempi includono riferimenti ^{1-6,7, 8).}

Protocollo

Materiali richiesti: Dissection stereo-microscopio, su due lati del nastro, vetrino da microscopio standard e coprioggetti, pinze dissezione (dimensione 5 o 5,5), spazzola a setole morbide, vuoto grasso al silicone, siringa da 5 cc, carta Whatman, confocale o microscopio a epifluorescenza con fotocamera digitale e immagine acquisizione del software.

1. Dissezione pupa

1. Impostare una croce (con la combinazione appropriata di GAL4 linea e un tag proteina di fusione GFP sotto controllo SUP) o vola posto da uno stock che si desidera immagine in diverse fiale fresco a 25 ° C.
2. Cellule SOP generalmente cominciano a proliferare sul torace pupa a diciotto ore dopo l'insorgenza di pupariation, abbiamo quindi selezionare pupe "bianco" dallo stock volare appropriato o croce. Bianco pupe hanno la morfologia pupa, ma hanno un caso non pigmentato pupa, che indica che che hanno pupariated entro un'ora.
3. Attendere circa 18 ore.
4. Posizionare un pezzo di nastro biadesivo sul vetrino. Raccogliere pupe e rispettare il caso pupa al nastro biadesivo con il lato ventrale verso il basso. Afferrare il bordo dell'opercolo (il portello circolare sulla punta anteriore dorsale del caso pupa) con la pinza
5. Sollevare delicatamente, rimuovere ed eliminare l'opercolo, rivelando la testa della mosca immaturo.
6. Usa le pinze per iniziare a strappi lungo il lato del case pupa. Sollevare la parte mediana del caso pupa dal lato strappato e portarlo verso il lato opposto, o rimuoverla completamente o allegarlo al nastro, rivelando la parte anteriore del torace e dell'addome. ( Nota: C'è un divario tra il volano di sviluppo e il caso pupa. Fare attenzione a non forare il volo come la parete della cassa è strappata.)
7. Inizia taglio lungo lo stesso lato della cassa pupa verso la fine posteriore. Ancora una volta, fare attenzione a non forare il volo. Tirare il caso pupa sul lato opposto della mosca e premerlo sul nastro biadesivo. L'addome dovrebbe ora essere completamente esposti. Posizionare la spazzola a setole morbide direttamente sotto la testa della mosca. Una volta che il volo è bloccato al pennello e libero del caso pupa, usare la spazzola per sollevare delicatamente il volano via della diapositiva.

2. Pupa di montaggio

Dopo la dissezione, pupe vengono poi montati tra vetrino e coprioggetto:

Isolato rimosso dal caso possono poi essere immessi sul centro di un lato dorsale di vetro slide up.
8. Fare un telaio quadrato di carta Whatman 18X18mm lasciando un 10x10 mm apertura nel mezzo. Carta immergere in acqua fino a saturazione. Luogo intorno alla pupa.
9. Usando una siringa da 5 cc riempita con grasso al silicone vuoto, applicare uno strato uniforme di grasso attorno alla cornice Whatman. Lo strato di grasso dovrebbe andare bene all'interno del coprioggetto (Figura 1) e lo spessore dovrebbe essere solo un po 'maggiore del diametro pupa.
10. Mettere una piccola goccia d'acqua (1 ml) al centro di un coprioggetto 22x22 millimetri e posizionare il coprioggetti sulla preparazione di sopra in modo che il piccolo contatti goccia d'acqua sulla superficie da immagine, notum in questo caso). Comprimere delicatamente a formare un sigillo completo di grasso vuoto e superficie di contatto piana tra il coprioggetti e cuticola pupa.
11. Prep possono poi essere ripreso sul microcopes invertito o verticale, utilizzando epifluorecence, confocale (scansione laser o spinning tipo di disco) oppure a due fotoni confocale. Se fate attenzione, le mosche adulte possono essere recuperati dopo alcuni giorni.

3. Rappresentante dei risultati:

L'utilizzo di un POS specifico per la linea GAL4 ( Neuralized-GAL4) attraversato da proteine ​​GFP tag per etichettare il fuso mitotico (tubulina o Tau-GFP) o proteine ​​istoniche (H2B-GFP), si può osservare aereo divisione della divisione cellulare SOP, la lunghezza del ciclo cellulare, o il numero di mitosi divisioni utilizzando lasso di tempo di imaging ⁹. Altre proteine ​​di fusione che obiettivo organelli cellulari come Rab GTPasi per segnare diversi comparti endocitico (Rab5-GFP per i primi di endosomi o Rab11 GFP per il riciclaggio endosomi) o proteine ​​importanti nella regolazione del segnale di Notch (Numb-, Partner di Numb-GFP, o Sanpodo -GFP) possono fornire importanti informazioni sui meccanismi della divisione cellulare asimmetrica e il traffico di proteine ​​di membrana ^2,3,7,10,11.

Figura 1: dissezione pupa e il montaggio. A. Passo-passo le immagini mostrano la procedura per rimuovere il caso pupa e preparare le pupe intatto per l'imaging cellulare montaggio e dal vivo. Pupe vengono rimossi dal flaconcino e posto, lato dorsale fino, sul nastro doppio bastone attaccato ad una lastra di vetro. Prima colonna, la rimozione del opercolo e strappi lungo il lato del case pupa. Seconda colonna, la rimozione del bozzolo da regione toracica e addominale. La pupa libero è poi sollevato dal caso pupa utilizzando un pennello. B. Montaggio pupe tra vetrino e coprioggetto. Pupa è posizionato sul lato dorsale sul vetrino, circondato da una cornice inumidito di carta Whatman. Un cordolo continuo di grasso al silicone estruso vuoto da una siringa funzioni 5cc per sigillare il vetrino coprioggetto-combinazione, proteggendo la pupa di essiccazione e di elevare il coprioggetto in modo che si appoggia delicatamente sul torace pupa. Una piccola goccia di acqua (1 mL) a livello di interfaccia tra il coprioggetti e la cuticola del torace migliora la qualità dell'immagine in modo significativo quando si utilizzano obiettivi ad immersione (acqua o olio). Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Figura 2: immagini rappresentative delle cellule SOP dal vivo e differenziati gli organi sensoriali esterni scattate con la nostra dissezione pupa e il montaggio procedura. A. Immagini estratte da una serie storica di una cellula SOP mitotico actina-GFP che esprimono proteine ​​di fusione sotto il controllo di Neuralized- GAL4 ( Neur- Gal4/UAS-actin-GFP), nota l'accumulo di actina corticale al solco della scissione (1 immagine / ogni 2 minuti). B. Cellule figlie SOP co-esprimono Partner di Numb-RFP (rosso) e Rab5-GFP guidato da Neuralized- GAL4, nota la distribuzione asimmetrica del Pon-RFP in una cellula figlia (pIIb) e la distribuzione dei primi endosomi in entrambe le cellule figlie. C. Rendering di volume di una serie Z conto dei differenziati organi sensoriali esterni in una fase tardiva pupa. Strutture cuticola, come mechnosensory setole e peli epidermici sono rivelate dalla cuticola autofluorescenza (rosso). Inoltre, abbiamo utilizzato il sistema MARCM di esprimere Lgl-GFP (guidato da Neuralized- GAL4) in un sottogruppo di cellule sensoriali precursore organo (verde). (Queste immagini sono state tutte acquisite utilizzando una Nikon C1 microscopio confocale utilizzando un obiettivo 60X 1,45 NA)

Discussione

In questo video, vi illustriamo una tecnica per l'isolamento e il montaggio Drosophila Pupaefor imaging cellulare dal vivo di cellule SOP sul notum pupa. Rimozione di pupe dal caso pupa richiede una mano ferma, strumenti adeguati, e una certa pratica, ma è facile da imparare. E 'importante che messa in scena di pupe essere fatto accuratamente, al fine di garantire relativa facilità di dissezione e cattura la fase di proliferazione di sviluppo SOP. Una volta montato, pupe continuerà a sviluppare tra vetrino e coprioggetto, e nella maggior parte dei casi, raggiungerà lo stadio pharate adulti, e alla fine Eclose. Nella nostra esperienza, delle cellule possono essere esposte nel corso di diverse ore. Questa tecnica di montaggio non si limita all'osservazione di cellule precursori PNS sul torace pupa, ma può essere utilizzato per visualizzare le cellule che sono vicini alla superficie cuticola e accessibile con l'obiettivo microscopio, (si prega di notare che le osservazioni sono fatte in una fase in cui il caso pupa può rimuovere senza uccidere la pupa, di solito circa 10 a 14h dopo la formazione puparium). Abbiamo proteine ​​giunzionali successo visualizzati, proteine ​​del citoscheletro e regolatori di traffico vescicolare nelle cellule epiteliali pupa (dati non pubblicati).

La tecnica di montaggio pupa ci ha anche permesso di sviluppare un metodo per strutture immagine cuticolare pupe in fase avanzata con il microscopio a scansione confocale, al fine di visualizzare la morfologia delle mechanosensory setole e peli epidermico con il autofluorescenza intrinseca della cuticola. Queste immagini assomigliano scansione microscopio elettronico della cuticola volare, ma può essere acquisita da animali vivi, e ci permettono di visualizzare contemporaneamente la morfologia cuticolare ed espressione di GFP fluorescenza ^6,7,12.

Materiali