손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

요약

이 비디오에서는, 우리는 불균형 그대로의 감각 기관의 전구 세포와 표피 세포를 나누지 라이브 셀 이미징에 대한 방법을 설명 Drosophila pupae

초록

그린 형광 단백질 (GFP)의 발견 이후, 기본적인 생물 학적 메커니즘을 이해하기위한 도구로 라이브 셀 이미징의 사용에 혁명적인 변화가왔다. 눈에 띄는 진전은 누구 광범위한 툴킷 돌연변이 유전자 변형 라인의 evolutionarily - 보존 발달 및 세포 생물 학적 메커니즘을 연구하는 편리한 모델을 제공합니다 Drosophila에서 특히 분명했습니다. 우리는 Drosophila에서 성인 말초 신경계 (PNS)의 제어 셀 운명 사양. 표지의 머리, 흉부, 복부, 다리 및 성인 비행 중 날개 개별 mechanosensory 장기 것을 Bristles하고, 연구하고있다는 메커니즘을 이해에 관심이있는 노치 - 의존 세포 운명 결정의 메커니즘을 이해하기위한 모델 시스템으로. microchaetes (또는 작은 bristles)의 감각 기관 전구체 (SOP) 세포는, pupal 흉부의 상피를 통해 배포되며, pupariation의 발병 후 처음 12 시간 동안 지정됩니다. 규격 후, SOP 세포가 유사 분열 동안 한 딸 세포로 감각 세포 운명의 결정자를 segregating, 분열 시작. 노치 신호 경로의 휴대 자율 억제제와 같은 감각 기능.

여기, 우리는의 조합을 사용하여 손상 pupal 흉부 이내 SOP 세포와 그 자손의 단백질 역학을 수행하는 방법을 보여 조직 특정 Gal4 드라이버와 GFP - 태그 융합 단백질 ^1,2.이 기법은 고정 조직이나 교양을 통해 이점을 가지고 explants 그것이 우리가 신경 전구체의 규격에서 성장과 장기의 단말기 분화하는 기관의 전체 개발을 수행하실 수 있습니다 때문입니다. 따라서 직접 터미널 차별화의 변화에​​ 셀 동작의 변화와 상호하실 수 있습니다. 또한, 우리는 돌연변이 또는 wildtype 조건 mitotic의 솝스에 태그 단백질의 역학을 평가하는 repressible 세포 마커 (MARCM) 시스템 모자이크 분석 라이브 이미징 기술을 조합하여 사용할 수 있습니다. 이 기법을 사용, 우리와 다른 비대칭 세포 분열의 조절과 세포 SOP (예제 참조 ^{1-6,7, 8을} 포함)에서 노치 신호 전달 활성화의 통제에 소설 통찰력을 밝혀있다.

프로토콜

필수 재료 : 절개 스테레오 - 현미경, 양면 테이프, 일반 현미경 슬라이드와 coverslip, 절개의 포셉 (크기 5 또는 5.5), 브러시, 디지털 카메라 및 이미지와 실리콘 진공 그리스, 5cc 주사기, 왓먼 종이, 공촛점 또는 epifluorescence 현미경을 부드럽게 bristled 수집 소프트웨어.

1. Pupal 해부

1. 는 25 몇 가지 신선한 튜브 안에 이미지하고자하는 주식 ° C.에서 (Gal4 라인과 UAS 통제 GFP 태그 융합 단백질의 적절한 조합을 사용) 간 또는 장소 파리를 설정
2. SOP 세포는 일반적으로 pupariation의 발병 후 십팔시간에서 pupal 근육 세포 분열 따위에 의해 번식하기 시작, 우리는 따라서 적절한 플라이 주식이나 십자가에서 "흰색"pupae을 선택합니다. 화이트 pupae는 pupal 형태가 있지만, 한 시간 이내 pupariated했음을 나타내는 unpigmented pupal 경우 있습니다.
3. 약 18 시간을 기다리십시오.
4. 슬라이드에 양면 테이프의 조각을 넣으십시오. pupae 수집 아래 복부 측면과 양면 테이프로 pupal 사건을 준수합니다. 포셉와 operculum의 가장자리 (pupal 케이스의 앞쪽에 지느러미 끝에 원형 해치를) 파악
5. 부드럽게 미숙 비행의 머리를 공개, operculum을 들어 제거하고 폐기.
6. pupal 케이스 측면을 따라 찢어 시작 포셉를 사용합니다. 찢어진 측면에서 pupal 사건의 midsection을 들어 반대편으로 데려와 역시 완전히 그것을 제거하거나 테이프에 그것을 첨부, 흉부와 복부의 앞쪽에 일부를 공개. ( 참고 : 개발 비행과 pupal 케이스 사이에는 큰 차이가 있습니다. 관통하는 사건의 벽로 비행이 졌지 않도록주의하십시오.)
7. 뒷부분 끝 부분 pupal 케이스 같은 편이 함께 절단 시작합니다. 다시 한번, 아니 소중히 파리를주의하십시오. 파리의 반대편에 pupal 사건을 당겨와 양면 테이프로 그것을 누르십시오. 복부는 이제 완전히 노출되어야합니다. 직접 비행의 머리 아래의 소프트 bristled 브러시를 놓습니다. 파리는 브러시와 pupal 가지 경우 무료로 붙어되면, 부드럽게 슬라이드에서 파리를 리프트에 브러시를 사용합니다.

2. Pupal 장착

절개 후, pupae 그 다음 슬라이드와 coverslip 사이에 탑재되어 :

절연 pupae 그런 다음 최대 유리 슬라이드 등의 측면의 중심에 둘 수 있습니다.
8. 중간에 오프닝 10X10 mm 떠나 왓먼 종이 18X18mm의 사각형 프레임을 만듭니다. 물에 담가 종이 포화까지. pupae 주변 놓습니다.
9. 실리콘 진공 그리스 가득한 5 CC의 주사기를 사용하여 왓먼 프레임 주위에 그리스의 유니폼 레이어를 적용합니다. 기름 층은 coverslip에 부합해야합니다 (그림 1)과 두께 pupal 직경보다는 약간 커야한다.
10. 22X22 mm의 coverslip의 중앙에 물이 작은 방울 (1 μl)을 놓고 위의 준비에 coverslip을 배치 같은 그 작은 물 비말 접촉이 경우에는 이미지, notum하고자하는 표면). 진공 그리스와 coverslip과 pupal 표피 사이의 평면 접촉면의 전체 도장을 형성 부드럽게 압축.
11. 준비가 다음 중 하나 epifluorecence를 사용하여, 거꾸로 또는 직립 microcopes에 몇 군데 수 있습니다 공촛점 (레이저 디스크 타입을 스캔하거나 회전) 또는 두 개의 광자 공촛점. 당신이주의하는 경우, 파리 성충은 몇 일 후에 복구할 수 있습니다.

3. 대표 결과 :

SOP 특정 Gal4 라인 (사용 neuralized - Gal4) mitotic 스핀들 (tubulin 또는 타우 - GFP) 또는 히스톤 단백질 (H2B - GFP)을 라벨 GFP 태그 단백질을 넘어, 하나는 본부 SOP의 세포 분열의 비행기, 세포주기의 길이, 또는 mitotic의 번호를 볼 수 있습니다 시간이 경과 이미지를 사용하여 부문 ⁹. 노치 신호 조절 (감각 -, 마비 - GFP, 또는 Sanpodo의 파트너로 중요 다른 endocytic 구획 표시하는 등 RAB - GTPases와 같은 세포 organelles를 대상으로 다른 융합 단백질 (조기에 대한 Rab5 - GFP가 endosomes 또는 재활용에 대한 Rab11 GFP가 endosomes) 또는 단백질 - GFP)는 비대칭 세포 분열의 메커니즘과 막 단백질 거래에 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다 ^2,3,7,10,11.

그림 1 : Pupal 해부 및 장착. A. 단계별 이미지 pupal 케이스를 제거하고 장착 및 라이브 셀 이미징에 대해 그대로 pupae를 준비하는 절차를 보여줍니다. Pupae은 유리 슬라이드에 부착된 이중 스틱 테이프에, 등의 측면을 유리병에서 제거하고 배치됩니다. 첫 번째 열에는, operculum의 제거 및 pupal 케이스 측면을 따라 찢어. 두 번째 열, 흉부 및 복부에서 pupal 가지 경우 제거. 무료 번데기 그런 다음 브러시를 bristled 소프트를 사용하여 pupal 사건에서 해제됩니다. B. 슬라이드 및 coverslip 사이 pupae 장착. 번데기는 왓먼 용지 moistened 프레임으로 둘러싸인, 유리 슬라이드 등의 측을 배치됩니다. 5cc 주사기 기능에서 압출 실리콘 진공 그리스의 지속적인 구슬 dessication에서 번데기를 보호하고 pupal 근육 부드럽게 달려 있도록 coverslip을 이팅, 슬라이드 coverslip 조합을 밀봉합니다. 침지 목표 (물 또는 기름)를 사용하면 coverslip 및 흉부의 표피 사이의 인터페이스에서 물 (1 μl)의 작은 방울은 크게 이미지 품질을 향상시킵니다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : 라이브 SOP 세포 및 pupal 절개를 사용하고 절차를 장착 촬영 차별화된 외부 관능 기관 대표 이미지.. 의 통제하에 굴지 - GFP 융합 단백질을 표현 mitotic의 SOP 세포의 시간 시리즈에서 추출한 이미지 neuralized - Gal4 ( neur - Gal4/UAS-actin-GFP), 절단의 고랑 (1 이미지 / 매 2 분)에서 굴지의 대뇌 피질의 축적을 기록해 둡니다. B. SOP 딸 세포는 감각 - RFP (적색)의 파트너와에 의해 주도 Rab5 - GFP를 공동으로 표현 neuralized - Gal4 두 딸 세포에서 하나 딸 세포 (pIIb)와 endosomes 초기의 배포 폰 - RFP의 비대칭 분포를 적어 둡니다. C. Z - 시리즈의 볼륨 렌더링은 늦은 pupal 단계에서 차별화된 외부 관능 기관의 촬영. 같은 mechnosensory 같은 표피 구조, bristles와 표피 머리카락은 표피 autofluorescence (적색)에 의해 공개됩니다. 또한, 우리는 Lgl - GFP를 (에 의한 표현 MARCM 시스템을 사용했습니다 neuralized - Gal4). (이 이미지들은 모두 60X 1.45 NA 목표를 사용하여 공촛점 현미경 니콘 C1을 사용하여 인수되었습니다)

토론

이 비디오에서는, 우리는 분리하고 장착을위한 기술을 설명 Drosophila pupaefor pupal notum에 SOP 세포의 라이브 셀 이미징. pupal 사건에서 pupae 제거는 꾸준한 손, 적절한 도구 및 연습이 필요하지만, 배우기 쉽습니다. pupae의 준비가 해부의 상대적 용이성을 보장하기 위해 및 SOP 개발의 확산 단계를 잡기, 정확하게 수행하는 것이 중요합니다. 일단 장착, pupae 슬라이드와 coverslip 사이에 개발하기 위해 계속되며, 대부분의 경우, pharate 성인 무대에 도달되며, 결국 eclose. 우리의 경험에서는, 세포는 몇 시간의 과정을 통해 몇 군데 있습니다. 이 설치 방법은 (관측이 단계에서 수행되는주의하십시오, pupal 근육 PNS의 전구체 세포의 관찰에 국한되지이지만, 표피의 표면에 가까운 현미경의 목표에 액세스할 수있는 모든 세포를 시각화하는 데 사용할 수있는 경우 pupal 경우) 보통 약 10 ~ 14h 번데기 형성 후 번데기를 죽이는 않고 제거할 수 있습니다. 우리는 상피 세포 pupal (게시되지 않은 데이터)에 성공적으로 시각 junctional 단백질, cytoskeletal 단백질 및 소포의 인신 매매 규제 있습니다.

pupal 장착 기술은 또한 mechanosensory의 형태 bristles과 표피의 본질 autofluorescence를 사용하여 표피의 머리카락을 시각화하기 위해, 우리가 스캔 공촛점 현미경을 사용하여 늦은 무대 pupae의 이미지 cuticular 구조하는 방법을 개발하도록 허용했다. 이 이미지들은 비행 표피의 전자 micrographs 스캔과 유사하지만, 살아있는 동물에서 얻은 수 있으며, 우리는 동시에 cuticular 형태학 및 GFP 형광 표현을 시각화 수 ^6,7,12.

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