测序外周血中细菌菌群：我们的经验与艾滋病毒感染者

摘要

我们的实验将展示如何执行转位HIV阳性患者的外周血中的细菌种类的测序分析。

摘要

生理健康的胃肠道是殖民地的影响共生微生物的体液免疫和细胞的粘膜^免疫系统1,2的发展的种类繁多。

屏蔽的微生物是通过一个强大的黏膜屏障的免疫系统。感染和抗生素被称为改变正常的消化道障碍和居民的细菌组成，这可能会在可能的^免疫异常导致3。

艾滋病毒会导致违反与胃肠黏膜免疫和全身血液循环进入细菌的生物制品，如内毒素和细菌的DNA片段，这^有助于全身免疫激活4-7泄漏的渐进破坏屏障。在艾滋病毒/艾滋病的免疫病理及^治疗 4,8微生物易位是牵连。

我们的目的是表征转位HIV感染患者的外周血中的细菌组成。为了追求我们的目标，我们成立了ribosomial panbacteric 16S基因测序分析PCR反应。

简单地说，艾滋病毒感染者和正常人全血使用。在这些患者中预计，鉴于目前健康的个人正常的肠道动态平衡没有菌群易位。静脉穿刺的全血和血浆分离收集，DNA是从血浆中提取和使用执行范围广泛的PCR反应ribosomial panbacteric 16S ^基因 9 。执行下面的PCR产物纯化，克隆和测序分析。

研究方案

对感染艾滋病毒的血液样本的处理需要一些重要的建议。
所有血液标本必须在强大的防漏容器运送。采集标本时，必须小心，以避免污染容器的外观和附带任何手续的标本。
所有处理受感染的血液的人必须戴手套。手套必须改变和标本的处理完成后洗净双手。
艾滋病毒感染者的血液样品的处理，必须做到在II级生物危害柜罩。
应采用机械吹打艾滋病。
必须加以限制，其中有别无选择的情况下使用的针头或其他锐器（包括玻璃如移液器或毛细管）。
实验室表面必须与适当的化学消毒剂后溢出的血液净化，工作时活动结束。
必须净化污染的材料使用或重复使用前必须正确处置医疗废物的路线通过。
每一个可能具有传染性的血液或体液（即那些需要的普遍预防措施）的职业暴露事件应被视为医疗紧急干预必须迅速启动才能有效。
该协议要求5天完成。详细的时间表是在图1。
使用图2中所描述的方法，确定细菌种类。

1。样品采集

1. 9毫升全血抽入EDTA的含管。
2. 于2000年在室温下10分钟的转速离心管获得等离子体。
3. 离子被收集在一个无菌2毫升的Eppendorf管。

2。血浆样品中的DNA提取

1. 充分消毒罩，吸液管和实验所需的材料，以保证无菌。
2. 位置至少30分钟，在紫外线灯的所有材料。
3. 用消毒液擦拭手套。
4. 浸泡在乙醇一些纸巾和引擎盖下。每次小费是被丢弃擦拭湿纸巾吸管。

DNA是使用商业套件制造商的说明（易DNA试剂盒，Invitrogen公司，卡尔斯巴德CA，美国）提取。

5. 350μL血浆放置在无菌2毫升Eppendorf管中。
6. 350μL超纯水过滤，作为阴性对照。
7. 添加10μL的溶菌酶（1mg/ml的）样品。
8. 30分钟在37 ° C。
9. 加入500μL裂解液，轻轻混匀样品。
10. 7分钟的孵育65 ° C。
11. 加入氯仿900μL的样品。
12. 涡大力直到样品均匀粘稠。
13. 添加200μL降水方案和涡大力。
14. 离心样品在室温下10分钟的转速在10500分开的阶段，并形成接口。
15. 上层水相转移到一个新的离心管中，含有1毫升乙醇100％。
16. 在4个样品离心10分钟的转速在10500 ° C。
17. 除去乙醇。
18. 加入乙醇70％1毫升。
19. 离心样品的最高速度为10分钟，在4 ° C。
20. 除去乙醇。应与pipettator删除残留的乙醇。
21. 在超纯水50μL重悬沉淀。
22. 用分光光度计读取DNA的浓度。

3。 16S rRNA基因的PCR

PCR扩增⁹如前所述。

1. 扩增100μL反应10 10X PCR缓冲液，5μL25 mM的氯化镁，2毫米的总dNTPs 5μL，50微米底漆RW01（AACTGGAGGAAGGTGGGGAT）1μL，1μL50微米底漆DG74液组成的混合物的DNA （AGGAGGTGATCCAACCGCA），34μL的H20和0.5μLTaq DNA聚合酶（AmpliTaq金牌，应用生物系统，福斯特城，加利福尼亚，美国）。
2. 为了避免可能造成的污染细菌Taq聚合酶，PCR混合物中的过滤器传输。
3. 离心过滤器（单片机，Millipore公司，比尔里卡，马萨诸塞州，美国）为30分钟，在500 RCF在4 ° C。
4. 分装在PCR混合物，根据需要放大（正面和负面的PCR控制，样品和提取的水）样本数。
5. 使用以下热循环条件：94 ° C为10分钟，每次1分钟的40倍，94 ° C，55 ° C和72 ° C，并在72 ° C 10分钟
6. 可视化的PCR产物在2％琼脂糖凝胶。使用100 bp的DNA阶梯。 PCR产物的大小约360基点（图3）。

4。 PCR产物纯化

只有PCR阳性标本应得到净化。净化是利用商业Kit中的下列制造商的说明（PureLink PCR扩增microkit，Invitrogen公司，卡尔斯巴德的CA，美国）。

1. 新增4卷结合缓冲液，每1体积的PCR产物中含有异丙醇。
2. 传输与一列的结合缓冲液PCR产物。
3. 在室温下在10000 RCF离心1分钟。
4. 与洗涤缓冲液含有乙醇洗净列。
5. 在室温下在10000 RCF离心1分钟。
6. 以最大速度离心1分钟在室温下干燥的硅膜，并删除任何残留的洗涤缓冲液，用乙醇。
7. 加入10μL超纯水。
8. 1分钟在室温下孵育。
9. 最大速度为2分钟，在室温下离心收集纯化的DNA。

5。克隆

溶原性肉汤（LB）板的制备

1. 溶于约800毫升的水混合的LB 25克。
2. 带来的最终体积至1 L。
3. 加入15克Bactoagar。
4. 高压灭菌器为20分钟。
5. 经过高压灭菌，大力摇动烧瓶中的解决方案混合熔化的琼脂。
6. 冷却到50 ° C的解决方案
7. 添加氨苄青霉素（50微克/毫升）和漩涡，直到完全溶解。
8. 倒入深约3毫米的钢板。
9. 离开板在室温下。
10. 传播的X加仑（40mg/ml）和IPTG每个LB平板上，孵育（100毫米），在37 ° C，直到准备使用。

感受态细胞转化

执行转换使用商业Kit中的下列制造商的说明（地形TA克隆试剂盒，Invitrogen公司，卡尔斯巴德的CA，美国）。

1. 准备克隆反应的组合（1-4μL新鲜的PCR产物，1μL盐溶液，如有必要的载体和水1μL）。
2. 轻轻混合反应，并在室温下孵育5-10分钟。
3. 广场上冰的反应。
4. 新增2成一小瓶主管细胞克隆反应液，轻轻混匀。
5. 在冰上孵育30分钟。
6. 热休克的细胞在30秒42 ° C。
7. 立即转移到冰管。
8. 添加250μL介质。
9. 第tighly管和动摇管水平在37℃1小时。
10. 50μL的蔓延，从每一个预热选择性板改造。
11. 过夜孵育在37 ° C。

潜伏期之后，白色和蓝色的菌落平板上发展。白色菌落呈阳性的PCR产物插入蓝色菌落PCR产物插入负。

6。测序分析

测序反应

1. 混合使用这些试剂：2,5μLDNA，1μL引物（5pmol /μL）1,1μLBigDye（应用生物系统，福斯特城，加利福尼亚，美国）。
2. 热循环条件：96 ° C为1分钟10秒，55 ° C的25倍为4分15秒和60℃96℃。

柱纯化

1. 对于每一个反应，准备一个MicroSpin列（QIAGEN，米兰，意大利）。
2. 反相柱和旋涡混合树脂。
3. 柱底部对齐关闭，松开盖子¼圈，并将其放置在离心管列。
4. 离心1分钟3200转。
5. 列转移到一个干净的离心管。
6. 仔细吸管中心列到整个PCR测序反应。
7. 离心1分钟3200转。
8. 纯化的DNA eluite管（20μL超纯水）。

测序分析

1. 纯化样品装入96多孔板（20μL）。
2. 加载到音序器板。自动化DNA测序生成四色色谱图显示的测序运行的结果。
3. 作为对公共序列数据库的查询输入的核苷酸序列。在NCBI数据库和服务器上执行搜索，基本局部比对搜索工具（BLAST）。
4. 只考虑有98-100％的同源性的细菌。

7。代表性的成果

图1。时间轴的过程。

图2整个细菌鉴定程序流程图。

图3显示广泛的16S rRNA基因的PCR产物2％琼脂糖凝胶。 1巷包含一个100bp的DNA梯状条带，2巷包含PCR阳性对照，泳道3显示负PCR控制。巷4显示了一个HIV阳性病人的样本，和5巷中含有水。 6巷SHOWS样品从一个健康的个体和阴性PCR反应; 7巷含有水。只有HIV阳性患者，显示了积极的PCR扩增。作为一个在提取步骤阴性对照用超纯水，表明没有发生污染。

图4。0.7％琼脂糖凝胶电泳显示质粒提取小量程序。 1巷包含1个碱基的DNA梯状条带，2巷包含蓝色的控制殖民地，车道从12月3日含有白色菌落。从蓝色菌落的质粒不包含的PCR产物插入。所有10个白色菌落中含有正确插入质粒。

图5显示了一个例子从一个艾滋病毒抗体阳性的个体血浆中的细菌测序分析。我们的结果表明，在HIV感染的微生物易位涉及到一个polimicrobic菌群，这是不是艾滋病毒阴性者中，建议在控制细菌移位肠道免疫功能的大量失败。

讨论

最可靠的结果是使用EDTA含管收集血浆时获得。采血后，血浆应通过离心分离2 / 3小时内，以避免溶血和DNA片段退化。第一样本储存在-20 ° C，约5天，然后在-80 ° C应避免多个冻融循环，这可能会导致细菌的DNA损失。

血浆样品应解冻后12小时内使用。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论（可选）
Easty - DNA试剂盒	Invitrogen公司	K 180001
氯仿	Sigma - Aldrich公司	C2432
乙醇	Sigma - Aldrich公司	E7203
超纯娃儿	Invitrogen公司	10977049
溶菌酶	Fluka公司	62970	10微克/毫升Distillated水
AmpliTaq金牌	应用生物系统	26478701
单片机100	Millipore公司	42413
PCR引物	Invitrogen公司
琼脂糖	Eppendorf公司	C1343
DNA梯状	Invitrogen公司	15628019
Purelink PCR扩增微套件	Invitrogen公司	K310050
LB琼脂，粉末	Invitrogen公司	22700025
Bactoagar	Invitrogen公司
氨苄青霉素	Invitrogen公司	11593027	10毫克/毫升Distillated水
X - gal的	Invitrogen公司	15520034	40mg/mL在DMF
经IPTG	Invitrogen公司	15529019	100MM在Distillated水
地形助教克隆试剂盒	Invitrogen公司	K450002
Purelink快速质粒小量制备试剂盒	Invitrogen公司	K210010
大染料	应用生物系统	4337455
DyeEx 2.0自旋套件	Qiagen公司	63204