高通量原位杂交方法表征在胎鼠下泌尿生殖道的基因表达模式

摘要

在这里，我们描述了一个高效的高吞吐量原位杂交（ISH）可视化mRNA的表达模式，在胎鼠的前列腺组织切片的方法。该方法可以很容易地适应可视化，在其他的鼠标组织或来自其他物种的组织的mRNA的表达模式。

摘要

较低的泌尿生殖道（LUT）的发展是一个复杂的的过程。这种复杂性体现在从依赖雄激素信号和上皮-间质相互作用^1,2胎儿男性尿道，前列腺的形成。了解前列腺发育的分子机制，可能揭示的增长是不恰当地从沉睡中苏醒过来，在以后的生活会引起良性前列腺增生和前列腺癌等前列腺疾病的机制。

发展LUT的解剖结构复杂。 16.5天的概念（DPC）的时间前列腺萌芽开始，许多类型的细胞存在。血管，神经和平滑肌驻留在间质的^基质 3 。这间质围绕着一个多层的上皮细胞和引起胎儿通过雄激素受体 ​​依赖旁分泌^信号 4前列腺。身份的基质雄激素受体反应的前列腺癌的发展，针对这些基因的前列腺导管上皮形式尚不完全清楚的机制所需基因。能够准确地识别细胞类型和本地化内表达的具体因素是要进一步了解前列腺癌的发展。原位杂交（ISH）允许一个组织内mRNA的本地化。因此，这种方法可用于识别信号分子及其受体的表达模式和时间，从而阐明潜在的前列腺发育调节。

在这里，我们描述了一种高通量的原位杂交技术来识别在胎鼠LUT的使用振动切片机切段mRNA的表达模式。这种方法提供了比其他ISH的协议几个优点。执行上坚持一个幻灯片的超薄切片的原位杂交是技术上的困难;冰冻切片经常有结构质量差而冰冻切片和石蜡切片，往往会造成弱信号的分辨率。执行整装组织的ISH，可能会导致探头捕获。相比之下，我们的高通量技术采用厚切的部分，显示详细的组织架构。修改离心管允许在原位杂交的过程中容易处理的部分。 4 mRNA转录的一个最多可从一个单一的LUT高达24 mRNA的单次运行中检测到的成绩单17.5dpc筛选，从而降低成本和最大限度地提高效率。这种方法允许多个治疗组相同，并作为一个单元处理，从而消除任何解释数据的偏差。大多数有针对性地对前列腺的研究人员，这种方法提供了一个在胎鼠尿道前列腺导管网络，使人们产生低和高丰度的mRNA转录的空间和时间的位置。

研究方案

1。地高辛- 11 - UTP标记Riboprobe从一个PCR生成的模板合成

1. 为了合成一个特定基因riboprobe，使用Entrez基因（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez）获得的基因的cDNA参考序列（的RefSeq） 。使用Primer3程序^{（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）5，}设计基因特异性PCR引物对cDNA序列的3' -地区。 PCR引物的选择推荐的参数描述（http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html）。
2. 使用MegaBLAST计划^{（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=10090）6，}评估所选择的DNA序列的特异性。 DNA序列被认为是特定的时候，使用0.01期望阈值，它不配合RefSeq数据库中的其他序列。
3. PCR扩增riboprobe模板。应该优化，以​​每个引物PCR反应的成分和热循环条件。一个典型的50μl反应体系包括：1X缓冲，2MM MgCl _2的 ，0.2MM dNTPs，1X Q的解决方案，1μg基因，2.5U的Taq DNA聚合酶，0.25μm的引物，无核酸酶的H _{2 O}一个典型的热循环协议包括变性94 ° C为2分钟，30秒94 ° C，40个周期，57 ° C为30秒，72 °，1分钟和10分钟在72℃最后延伸彗星。在PCR反应中使用的基因是从小鼠的泌尿生殖系统mRNA的合成。
4. 琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，纯化使用凝胶提取试剂盒，并量化分光纯化产物。预期收益率是1.2 - 3.6μg。
5. 转录成标记riboprobe的PCR产物。转录反应（40μL）包含：400ng纯化的PCR产物，1X核苷酸标签组合包含1X转录缓冲液，地高辛11双绞线，5U RNase抑制剂，80U T7 RNA聚合酶，无核酸酶的H _{2 O} 3 - 4小时在37℃，搅拌样品每次30min。
6. 使用Qiagen公司的RNeasy试剂​​盒，根据清理柱上的DNA酶消化RNA的指示，以净化riboprobes。用分光光度法定量riboprobes。预期收益率是4-20微克。评估探头质量1.5％的非变性琼脂糖凝胶电泳分离等分。高品质的探针迁移以最小的涂抹不同的波段。
7. 为了确保riboprobe明确承认其目标，包括第一原位杂交实验的阳性对照组织。 riboprobe的靶mRNA模式应该知道在这种积极的控制组织。

2。振动切片机刀片的制备（基于先前所描述^的协议）7

1. 准备在4％的低熔点琼脂糖溶液磷酸缓冲液（PBS）。微波解决方案溶解琼脂糖和维护解决方案在62 ° C。
2. 准备从直径12mm Millicell小培养板取出膜以及插入和保留聚苯乙烯环使用琼脂糖模具聚苯乙烯环模。浸泡RNase抑制剂溶液过夜每次使用前的戒指。
3. 为了确保顺利的切割面，删除以下溶剂清洗，从威尔金森刀片表面的防锈剂和其他添加剂，在浓度为100％：石油醚，二甲苯，氯仿，甲醇，MilliQ水。双层刀片纵向分开成两个单叶片。
4. 坚持威尔金森刀片切片机刀片与乐泰胶。切片机刀片用于切割，它增加了刚性，威尔金森刀片。切片机刀片，应减少使用金属剪刀，一旦坚持威尔金森刀片长度，应抵消了3 - 4mm的威尔金森刀片的切削刃。

3。夹层，存储和泌尿生殖系统组织切片的制备

1. 准备PBSTw解决方案（PBS含0.1％吐温™20和0.2mm的叠氮化钠，通过0.22μm的Stericup过滤®过滤装置）。解决方案可以提前做好准备，并储存在25 ° C
2. 孵育新鲜解剖小鼠LUT（膀胱，骨盆尿道，以及相关的沃尔夫和Mϋllerian管派生结构）在4℃过夜°彗星在PBS中含4％多聚甲醛固定液。
3. 脱水洗涤10min后在25 °分级甲醇/ PBSTw（1:3，1:1，3:1 V / V）的解决方案系列中的彗星组织。在-20 ° C时，至少隔夜在100％甲醇的商店样品。存档的组织可能保持至少2yr。
4. 准备补水存档组织切片组织。 10min后洗净，在25 °一系列分级甲醇/ PBSTw C（3:1，1:1，1:3 V / V）的解决方案。
5. 解剖并丢弃约三分之二的膀胱，而使尿道三角地区最。

4。泌尿生殖道组织中嵌入琼脂糖

1. 将聚苯乙烯环模，平坦的表面向下，25 ° C的普通玻璃显微镜玻片上。
2. 填写与62℃的琼脂糖溶液约2分钟冷却环模。
3. 从PBSTw删除LUT的组织和印迹吸水擦拭干。
4. 琼脂糖溶液转移到组织。
5. 东方的组织，以便它是中途暂停环模的顶部和底部之间，组织孵育4℃直至琼脂糖凝固的琼脂糖LUT的使用镊子。
6. 如果组织汇完全在琼脂糖凝固过程中，可以从琼脂糖和重新嵌入切除。在重新嵌入的过程中需要调整琼脂糖冷却时间。

5。泌尿生殖系统组织切片随着振动切片机（基于先前所描述的协议^） 7

1. 安装在振动切片机的钢筋威尔金森刀片和叶片角度35 °。填写豪华标本用PBS和包装周围的标本浴湿冰浴。
2. 从环模中取出凝固的琼脂糖插件和杂交用吸水擦拭底部表面。确认组织的方向正确。组织的方向可以调整使用刀片斜角平边的琼脂糖插件。
3. 坚持琼脂糖插件安装如图所示的乐泰胶粘剂的磁盘到振动切片标本。 1A。
4. vibratome插入试样安装磁盘。
5. 切片机切片厚度为50μm，速度为2，和刀片幅度调整到4，并开始切割组织切片。
6. 使用钝钳，每个组织切片（ 图1B）转移到24孔培养板以及包含冰冷0.5ML PBSTw。
7. 为了准备样品周围的每个组织切片（剩余的琼脂糖融化在原位杂交的过程中）琼脂糖的原位杂交，消费和删除所有关联的碎片。商店的部分达48小时，在4 °在PBSTw彗星。

6。样品篮准备在原位杂交

1. 削减在100μL商标离心管底部。
2. 热管火焰切割边缘，直到塑料软化，然后用力按压到了0.5英寸的聚酯丝网广场中心的离心管。
3. 修剪多余的网格，使用到每个管盖了激烈的18号针头刺穿两个洞完成篮子准备（ 图1C） 。
4. 取出24孔板的盖子，对每口井为中心钻12毫米的孔。使用盖子转移样品筐之间的ISH的协议洗涤（ 图1D）。

7。胚胎粉的制备原位杂交（基于先前所描述的协议^） 8

1. 正在评估组织部分相同的阶段，并储存在-80 ° C小鼠，收集小鼠胚胎组织放入陶瓷砂浆，淹没组织在液氮中冷冻组织，并使用杵研磨成细粉的组织。
2. 结合胚胎丙酮与4卷粉和同质化与几个招一个dounce匀浆。
3. 匀浆液转移到15ML的玻璃螺杆样品瓶，并提取一夜之间在4 ° C
4. 球在5000RPM离心10min后胚胎粉在4 ° C。取出并丢弃上清液含脂。重悬新鲜丙酮4vol组织沉淀和提取2小时4 ° C。
5. 颗粒在5000RPM离心10min后的胚胎粉在4 ° C。取出上清液。
6. 空气干燥2号的Whatman滤纸上沉淀。粉碎颗粒细粉和储存在一个密封的玻璃小瓶，收益率在4 ° C。近似​​的收益率是50毫克每1克胚胎湿重的粉末。

8。 原位杂交第1天

1. 预热预杂交液（50％甲酰胺，SSC的5倍，1％阻断试剂，酵母tRNA10μg/mL，10μg/mL肝素储存在-20 ° C）至60.5 ° C。该解决方案可提前做好准备，并储存在-20 ° C
2. 准备一个小塑料存储容器灌装自来水约0.5加湿杂交腔。盖容器和预热至60.5 ° C。
3. 加入2ml PBSTw 24孔培养板内的水井。将样品在24孔板盖和转移组织切片，入筐（每筐多达10个路段已被用于）的孔筐。
4. 组织切片孵育30min后在25 ° C的6％H _{2 O 2。}这和所有后续孵化应进行轨道摇床轻轻摇动，除非另有说明。所有孵化一个ð洗24孔板进行，并使用了2mL/w​​ell的整体解决方案的体积。
5. 组织切片洗净，于25 °彗星在PBSTw 4 × 5分钟。
6. 孵育12分钟的组织切片在25 °在PBSTw彗星含有5μg/mL蛋白酶K
7. 组织切片洗净，于25 °彗星在PBSTw 1 × 5分钟。
8. 20分钟后修复组织切片在25℃的PBS彗星含有4％多聚甲醛和0.2％戊二醛。
9. 组织切片洗净2 25 × 5分钟°在PBSTw彗星。
10. 添加预热预杂交缓冲2mL/w​​ell和孵化组织切片内至少1小时的加湿杂交室为60.5 ° C。
11. 添加在每口井，并培育的组织切片，在加湿杂交室内过夜0.65μg标记riboprobe预杂交缓冲为60.5 ° C。

9，2日在原位杂交

1. 准备杂交后的洗涤步骤如下解决方案：解决方案1（50％甲酰胺，SSC的5倍，1％SDS），解决方案2（10MM的Tris - HCl pH值7.5，0.5M氯化钠，0.1％吐温™20，0.2mm的叠氮化钠0.22μm的过滤），和解决方案3（2X SSC，50％甲酰胺）。这些解决方案可以提前做好准备。在-20 ° C和解决方案2的存储解决方案1和3是存储在25 ° C。贮存寿命的解决方案是至少3个月。
2. 组织切片洗净，为60.5 3 × 30分钟℃，预热解决方案1。在洗涤过程中使用湿盒。
3. 组织切片洗净60.5 1 × 10分钟° C预热的解决方案1/Solution 2（1:1 V / V）溶液。使用在洗湿盒。
4. 组织切片洗净2解决方案在25 ° C，4 × 10分钟。
5. 在37 °溶液C含有0.25μg/mL核糖核酸组织部分为15分钟。
6. 组织切片洗净，25 1 × 10分钟°与解决方案2℃（无核糖核酸）。
7. 组织切片洗净，25 1 × 10分钟° C的解决方案3，2 X1hr 60.5℃清洗解决方案3。使用在60.5℃洗湿盒。
8. DIG标记riboprobes的免疫组化检测的准备下面的解决方案：组织封闭液（结核病，1X TBS的，10％羊血清，1％阻塞试剂，1％BSA，0.1％吐温™20，0.22μm的过滤），抗体稀释缓冲区（AD，1xTBS，5％羊血清，1％阻塞试剂，1％BSA，0.1％吐温™20，0.2mm的叠氮化钠，0.22™）抗体吸收液（AA，1xTBS，5％羊血清，1米过滤％阻断剂，1％BSA，6mg/mL胚胎粉），并TBSTw（1xTBS，0.1％吐温™20，0.2mm的叠氮化钠，0.22μm的过滤）。这些解决方案可以提前做好准备。 TBSTw是储存在25 ° C，所有其他的解决方案是储存在-20 ° C。
9. 洗3 × 10分钟在25 °与TBSTw彗星。
10. 孵育至少在2小时25 ° C的结核病缓冲区的组织切片。
11. 虽然组织结核病缓冲区的孵化，添加AA每200μL缓冲液1.1μL抗- DIG抗体，每孔。孵育机管局缓冲区+抗体至少在2小时4 ° C，然后在1分钟10000转离心。取出AA缓冲上清，将它添加到AD的缓冲液2ml。
12. 结核病缓冲区取出组织切片，并培育他们在4个湿盒过夜° C AD中含有抗体的缓冲区。

10日在原位杂交。

1. 准备彩色的开发解决方案NTMT（100MM的Tris - HCl pH值9.5，100mm的氯化钠，氯化镁₂ 50MM，0.2MM的叠氮化钠，0.22μm的过滤）。该解决方案可提前做好准备，并储存在25 ° C之前使用，添加2MM左旋咪唑和0.1％吐温™20。
2. 删除从井和存储解决方案，在4 ° C的抗体溶液（公元缓冲区+抗体）它可重复使用两个额外的时间。
3. 洗净组织8 × 10分钟25 °与TBSTw彗星含有2mm的左旋咪唑。
4. 小心地从篮子转移到培养皿中含有TBSTw组织。使用镊子去除可见的碎片。转移到干净的离心管组织。
5. 洗净组织1 × 10分钟在25 °与1ML NTMT。
6. 删除NTMT和一个含有50％NTMT（含2MM左旋咪唑）和50％BM紫，地方管，轻保护箱孵育25的混合物添加1mL/tube ° C。颜色的开发时间从数小时至数天不等。如果颜色是发展缓慢，100％的骨髓紫都可以使用。
7. NTMT / BM紫色的解决方案显示器色彩的发展和变化，如果积累沉淀的晶体或如果它经历了从黄色到紫色的颜色变化。 （4-250小时），全彩色的发展后，洗净组织2 × 5分钟，25 °彗星含有2mm的左旋咪唑NTMT 1mL/tube。
8. 组织过夜孵育4 ° PBS 1mL/tube中的C含有4％的多聚甲醛后固定液。
9. 漂白的组织，在25 ° 30分钟的孵育组织PBSTw 1mL/tube中的C _含 3％H 2 O 2 。然后洗净组织25 1 × 10分钟° C在PBSTw 1mL/tube和储存在4℃PBS 1mL/tube中的C含4％多聚甲醛固定液后。
10. 组织切片装在载玻片上，coverslipped，和一个复式显微镜成像。

11。代表性的成果：

琼脂糖LUT的组织的空间定位，决定组织切片的飞机。矢状部分，至少三分之二的膀胱切除，其余的LUT组织嵌入琼脂等，尿道中线琼脂糖插头（ 图1A）平坦的表面平行。在组织平面的一些小的调整可以由平边倒角的琼脂糖插件。从17.5dpc男性的LUT组织代表矢状切面，在这架飞机是面向如图1b所示。

样品篮，防止丢失和细腻的组织切片，在多天的ISH的过程中积累的灰尘和颗粒物。样品筐准备熔点聚酯丝网砍完一个1.5ml的离心管（ 图1C）。有一个小孔刺穿到每个样品篮盖，以方便流入和流出的花篮的解决方案流。样品篮暂停在ISH的解决方案，将它们放在12毫米孔钻成24孔板盖（ 图 1D ）。修改后的板盖，支持24孔板转移过程中的解决方案改变时，它们之间的篮子。

这是具有挑战性的限制在低丰度mRNA的检测所需时间的潜伏期长的非特异性背景染色。此外0.2mm厚叠氮化钠样本缓冲区，并随后将其过滤，通过0.22μm的过滤器出现限制背景染色（图 2 ）。使用这里介绍的方法，但不会出现背景染色明显的差别，样品时，在色彩的开发解决方案培养一个长期的时间段（ 图 3 ）。

图1。鼠标降低泌尿生殖道（LUT），组织切片和离心管一篮子为ISH的准备。一个LUT包含膀胱，骨盆尿道及相关沃尔夫和Mϋllerian管派生的结构）的一部分嵌入在4％低熔点琼脂糖的圆柱型插头。 （一）该插件是粘到样品安装盘和（二）用振动切片机切到50μm的部分。 （c）一个LUT的部分转移到微量离心管中篮，被刺穿了一个洞，入管的盖子和融合聚酯丝网管切底准备。 （四）的离心管插入12毫米孔钻成24孔板盖在缓冲溶液中悬浮在ISH的协议，使组织切片。箭头指示LUT的组织在琼脂糖插件。

图2团0.2mm厚叠氮化钠为0.22μm的过滤解决方案，提高组织的质量并降低背景染色。 17.5dpc雄性小鼠降低泌尿生殖道（LUTS）在矢状面厚度为50μm的切片。使用针对扭同源1探针原位杂交组织切片染色。 ISH的使用缓冲区是（A），0.22μm的过滤，并辅以0.2mm厚叠氮化钠（NaAz）或（B）与NaAz过滤并辅以。箭头指示的背景染色。在相同的放大倍率图像被抓获。结果是代表染色N = 3的垃圾的独立小鼠模式。

图3。背景染色强度不会出现长时间的颜色发展增加。 17.5dpc雄性小鼠降低泌尿生殖道（LUTS）在矢状面厚度为50μm的切片。第孵化chromagen染色液染色（一）9.5h使用探针承认的高丰度成绩单雌激素相关受体γ（Esrrg），（B）为43.5h使用探针承认的中等丰，通过原位杂交成绩单溴锌指结构域附近，2A（Baz2a），或（C）236H使用探针，认识到低丰度成绩单翅型MMTV整合位点的家庭，成员10A（Wnt10a）。在相同的放大倍率图像被抓获。结果是代表染色N = 3的垃圾的独立小鼠模式。

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讨论

使用这里介绍的方法，它可以检测到在所有主要类型的细胞和胎儿的雄性和雌性小鼠的LUT，包括间质垫，尿路上皮，平滑肌，前列腺芽，射精管，及阴道组织的车厢的mRNA。在本议定书中所使用的50μm的部分有足够厚，以解决组织架构（如血管）的优势，但足够薄，以避免探头诱捕，这是一个方法论的问题，在整个安装ISH普遍遭遇。每一个新的riboprobe评估阳性对照组织，染色已在先前发表的研究报?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号
抗地高辛抗体Fab片段	罗氏应用科学部	11214667001
阻断试剂	罗氏应用科学部	11096176001
BM紫美联社衬底，沉淀	罗氏应用科学部	11442074001
牛血清白蛋白	Fisher Scientific则	BP1600 - 100
细胞培养板，以及24	康宁	3524
地高辛11 -双绞线	罗氏应用科学部	1277073910
dNTPs	罗氏应用科学部	11969064001
双刃刀片	威尔金森剑	经典模型
Eliminase核糖核酸卸妆	DECON实验室	1102
甲酰胺	西格玛	F5786 - 1L
凝胶提取试剂盒	Qiagen公司	28704
戊二醛，25％的H 2 O的解决方案	西格玛	G6257 - 100ML
肝素，钠盐	西格玛	H3393
过氧化氢 ​​，30％的溶液中H 2 O	Fisher Scientific则	BP2633 - 500
左旋咪唑	西格玛	L9756
乐泰404快速设置瞬间粘合剂	汉高公司	46551
氯化镁	Fisher Scientific则	M33 - 500
马来酸	西格玛	M0375 - 500G
离心管，1.5ml的	Biologix研究公司	BP337 - 100
Millicell小文化板插入	Millipore公司	PICM01250
分子研磨树脂	G - Biosciences公司	786 - 138PR
多聚甲醛，4％的磷酸盐溶液缓冲液	Affymetrix公司	19943
磷酸盐缓冲液，无钙和镁	MP生物医学	ICN1760420
聚酯网，33微米，12“× 24”	小零件公司	CMY - 0033 - D
20mg/ml蛋白酶K溶液，	AMRESCO	E195 - 5ML
QIAshredder列	Qiagen公司	79654
Q解决方案	Qiagen公司	提供Taq DNA聚合酶
核糖核酸酶	西格玛	R6513
RNase抑制剂	罗氏应用科学部	03335399001
的RNeasy微型试剂盒	Qiagen公司	74104
的RNeasy微型试剂盒	Qiagen公司	74104
RQ1 RNase的免费DNA酶	Promega公司	M6101
SeaPlaque低熔化琼脂糖	龙沙	50101
羊血清	西格玛	S2263 - 500ML
Stericup过滤装置，0.22μm的，聚醚砜，500ML	Millipore公司	SCGPU05RE
叠氮化钠，呈颗粒状	Fisher Scientific则	S227I - 100
氯化钠	Fisher Scientific则	BP358 - 212
十二烷基硫酸钠	Fisher Scientific则	S529 - 500
南南合作，20X解决方案	研究产品国际	S24022 - 4000.0
标III第一链合成系统	Invitrogen公司	18080-051
T7 RNA聚合酶	罗氏应用科学部	10881767001
Taq DNA聚合酶	Qiagen公司	201203
的Tris - HCl	Fisher Scientific则	BP153 - 1
吐温20	Fisher Scientific则	BP337 - 100
与豪华标本浴振动切片机	徕卡显微系统	VT1000A
酵母tRNA	罗氏应用科学部	109495