IgY的技术:从蛋黄鸡抗体提取聚乙二醇（PEG）降水量

摘要

这个协议描述，尤其是从蛋黄IgY的提取由聚乙二醇沉淀的手段，并给出了有关IgY的技术信息。

摘要

母鸡可以通过IM疫苗接种（ 胸肌 ，左，右，注射量为0.5-1.0毫升）的手段，或通过质粒基因枪免疫接种。依赖于抗原的免疫原性，高的抗体滴度（高达1:100000 - 1:1,000,000）可以达到后，只有一个或3 - 4提高免疫接种。通常，一只母鸡下蛋持续约72周，随后铺设能力下降。这个协议描述手段（PEG.波尔森等人 ，1980年）的降水过程，从蛋黄中总IgY的提取。该方法包括两个重要的步骤。第一个是清除血脂，第二个是从第一个步骤上清总IgY的降水。反对的缓冲液（通常PBS）透析后的IgY的提取物可以储存在-20 ° C了一年多。提取的纯度在80％左右，每个鸡蛋的总IgY的不同从40-80毫克，依赖于蛋鸡年龄。总IgY的母鸡的年龄大约为40毫克/蛋高达80毫克/蛋（关于PEG沉淀）含量的增加。铺设了母鸡每年的容量大约为325鸡蛋。这意味着潜在总收成的20克总卵黄/年的平均卵黄含量60毫克的总IgY的/蛋（见表1）的基础上。

研究方案

1。通过PEG沉淀提取协议 - 卵黄

图1给出了一个IgY的提取过程示意图（见表2）。该协议最初是在波尔森等 。 1980年。
使用乳胶手套，应执行的所有步骤。

1. 仔细蛋壳破裂，蛋黄转移到一个"蛋黄勺"，以尽可能多的蛋白尽可能删除。
2. 蛋黄是转移到滤纸和冷轧删除余下的蛋清，蛋黄皮肤被切断与柳叶刀或类似工具（枪头）。倒入50毫升管蛋黄和蛋量（V1），注册。
3. 两次蛋黄体积的PBS混合蛋黄（ΣV1+ V2），其后为3.5％PEG 6000总量（克，煤粉）和振荡，其次是在一个滚动的混频器滚动10分钟。这一步分离提取过程分两个阶段进行停牌。一个阶段，包括"蛋黄固体和脂肪类物质"（原报价波尔森等人，1980年）和水样含有卵黄抗体和其他蛋白质的阶段。
4. 离心管是在4 ° C为20分钟（每分钟10000转13000 XG，贺利氏Multifuge 3SR +固定角度转子）。上清（V3）浇通过折叠滤芯，并转移到一个新的管。
5. 添加8.5％聚乙二醇6000克（根据新卷）管，振荡并在第3步中的滚动搅拌机推出。
6. 重复第4步的差异，被丢弃上清。
7. 仔细颗粒溶解在1 mL PBS玻璃棍和vortexer。 PBS是一个10毫升的最终卷（V4）。解决的办法是混有12％的PEG 6000（W / V，1.2克），并在第3步（旋涡，滚动混频器）治疗。
8. 重复步骤6和800μLPBS溶解沉淀仔细（玻璃粘和涡）。等待气泡消失，然后转移（​​吸管）洗肾胶囊提取。 400μLPBS冲洗管和添加量的透析设备（V5）。 （见透析设备和膜的制备附录。）
9. 提取物是夜间透析超过0.1％的盐水（1600毫升），通过磁力搅拌器轻轻搅拌。第二天早晨，用PBS代替生理盐水，再过三个小时的透析。
10. 此后IgY的提取物是从透析胶囊拉吸管，并转移至2ml管。最终体积约2毫升（V6发动机）。
11. 光度测量的样品的蛋白质含量（毫克/毫升）是在280 nm（用PBS稀释1:50），根据朗伯 - 比尔定律计算为IgY的消光系数为1.33（见图2），图。 4显示了该制剂的质量（纯度和回收率都在80％左右）。
12. 这是最好存储在样品分装于-20℃（不冻结的样品在-70 ° C）。
13. 在朱庇特的协议描述http:/www.jove.com/details.php?id=1916的最后准备工作的质量是由简单的SDS - PAGE分析

2。附录使用前透析袋，必须根据制造商的建议，准备以下列方式:

1. 20透析袋切割件30厘米，在一个2000毫升的玻璃烧杯。
2. 1750毫升5毫米EDTA解。
3. 一个玻璃漏斗放在袋以上，以确保袋是由EDTA溶液。解决的方法是加热煮沸5分钟（热板）。解决的办法是转自袋是用蒸馏水洗涤三次。
4. 再次1,750毫升EDTA的解决方案，补充说，煮沸5 min，用蒸馏水洗涤三次以上。
5. 最后，透析袋煮沸蒸馏水10分钟，并保存在4 ° C。消毒镊子取出透析袋。

3。代表性的成果

图1。卵黄提取的示意图，根据聚乙二醇沉淀波尔森等人的原始描述。 1980年， 要查看一个较大的图像，请点击这里 。

图2的年龄依赖性的免疫母鸡的鸡蛋蛋黄中总IgY的发展。是每周平均总IgY的/蛋和SD（N = 4蛋鸡）。从[Pauly 等人，2009年]）。

图3。拉依吴四只蛋鸡，不同的抗原免疫能力监测。箭头指示免疫日期（从[Pauly 等人，2009年]）。 查看大图请点击这里。

图4。还原条件下个人IgY的准备工作，从不同的鸡蛋聚丙烯酰胺凝胶电泳
巷1 - 2巷 - IgY的标准，巷3-5 - 不同IgY的样品分子量标记，准备在协议中所述。这些最后的准备，根据该协议的步骤10。慧聪 - 重链，液相色谱 - 光chaines，？ -相应的分子量约35 kDa的（可能卵黄二，易制毒化学的C -末端片段，[Klimentzou等，2006]）的细微杂质。

	鸡21（抗原A）	鸡22（抗原A）	鸡19（抗原乙）	鸡23（抗原彗星）
产蛋数（总IGY）1，2年期	625（38克）	626（38克）	545（33克）	608（37克）
产蛋数（总IgY的），第一年	345（20克）	304（16克）	326（18克）	308（17日克）
产蛋数（总IgY的），第二年	280（18克）	322（21克）	219（15克）	300（20克）
％最大。可能产蛋数（第一年）2	106	93	100	95
％最大。可能产蛋数（第二年）	86	99	67	92
加工蛋	565	620	283	401

¹ IgY的总额是60毫克每鸡蛋的蛋白质，根据图2中的数据的平均值乘以一个鸡蛋的数量计算。

²最大。根据饲养员的信息可能每年产蛋数为325。

表1。两年的统计数据具有不同的抗原免疫鸡的产蛋能力。铺设与不同的抗原，以及在两年IgY的结局后的免疫能力，最多四只蛋鸡％（参见图3）， 保利等人，2009年] ）。

蛋NR。	母鸡NR。布设日期	V1 [ML]蛋黄	V2 [ML] PBS	1。聚乙二醇PREC。 [G]	VOL [ML]后	2。聚乙二醇PREC。 [G]	弹丸	3。聚乙二醇PREC。 [G]	弹丸	VOL [毫升]	总蛋白毫克/毫升	矫正总蛋白毫克/毫升
			2xV1ΣV1+ V2	3.5％W / V]ΣV1+ V2	PREC。centrif。和过滤的V3	8,5％[W / V] V3	溶解于毫升PBS V4	12％[W / V] V4	溶于毫升PBS V5	经过透析对PBS V6	A280/ml	A280/ml:1.33
1	H293 / 22.10。	15	30 45	1.58	31	2.63	10	1.2	1.2	1.7	35.0	26.3
2	H293 / 23.10。	13	26 39	1.37	25	2.12	10	1.2	1.2	1.7	28.8	21.6

表2 PEG沉淀模范协议。

讨论

选择一个合适的IgY的提纯方法是影响净化（实验室或工业），成本效益，技术（实验室设备），和对环境的影响（废物管理）的规模。德Meulenaer Huyghebaert（2001年，审查也看到SCHADE 等 ，2005）详细审查各种IgY的提取方法。在一般情况下，这些方法可分为三个主要群体:

1. 沉淀法:涉及铵或硫酸钠，聚乙二醇（PEG），辛酸和caragenean。
2. 色谱方法:thiophylic相互作用层析，疏水层析，亲和层析，离子交换层析，凝胶过滤色谱。
3. 超滤 。

IgY的制备纯度可提高相结合的方法，例如，PEG沉淀可与亲和层析结合。在某些情况下，取决于最终的应用程序，IgY的水提取物足以达到良好的效果（秋田县井1993年）。根据我们的经验，IgY的样本，我们获得PEG沉淀在很多不同的免疫检测工作非常出色。通过规范的PEG沉淀法，一个技术助理是能够处理约84鸡蛋每星期，这相当于4至7克，每周的总卵黄金额。一个简单的计算:一个蛋鸡是一种抗原免疫接种。经过几次提高免疫接种母鸡的生产与1:50,000滴度的特异性抗体（AB）在为期30天。 30鸡蛋× 2毫升卵黄提取物（见协议和图3），相当于总卵黄60毫升，这反过来又对应AB - 3000升的稀释（一斗的容量为10升），这意味着有3000升AB的解决方案，300桶，可填补。因此，在数量如此巨大的AB -的存储稳定的质量和特异性抗体池，它是没有问题的。这种技术减少了充电/很多的可变性，否则在多特异性抗体观察。

尽管数量方面，卵黄抗体与哺乳动物IgG抗体相比有更多的优势:没有激活哺乳动物补体系统，没有交叉反应HAMA（人抗鼠抗体），类风湿因子或人类的血型抗原（heteroagglutinins缺乏）。

卵黄抗体的一个突出的优点是所谓的进化距离。亲缘距离是经常描述的哺乳动物和鸡的抗体特异性之间差异的原因，即使在相同的免疫。除了哺乳动物和禽流感的免疫系统本身之间的差异，在进化发展的差异，这两个动物类AB不同的特殊性。几位作者报道，鸡往往会产生ABS对系统发育上高度保守的哺乳动物蛋白或多肽更有效地比兔（审查SCHADE等A. 2005）。因此，可以保持一个保守的抗原"蒙面"兔的免疫系统，从而导致只有微弱或"沉默"回应。此外，如果鸡兔是哺乳动物具有相​​同的抗原免疫的，往往是鸡与AB -特异性，很少能在兔子取得回应。动物福利方面是重要的，因为是AB从蛋黄中提取的非侵入性。结合基因枪（质粒）免疫IgY的生产是完全非侵入（Witkowski 等 2009）。

总之，母鸡和PEG沉淀IgY的提取生产的AB是非常符合成本效益和高度特异性的与稳定的滴度AB以1:1,000,000结果。由于鸟类和哺乳动物之间的进化距离，鸡能够产生对特定的高度保守的哺乳动物抗原抗体，如兔。 IgY的技术获得数额特别巨大的AB，打开门也使用在人类医学和兽医学卵黄抗体治疗/预防的目的。

材料