טכנולוגיה IgY: הפקת נוגדנים מן עוף חלמון ביצה על ידי פוליאתילן גליקול (PEG) רטיבות

Summary

פרוטוקול זה מתאר מיצוי מסוים של IgY הכולל חלמון ביצה באמצעות משקעים פוליאתילן גליקול ונותן מידע כללי על טכנולוגיה IgY.

Abstract

תרנגולות ניתן לחסן באמצעות החיסון im (שריר הפקטוראלי, שמאל וימין, נפח הזרקה 0.5-1.0 מ"ל) או באמצעות חיסון פלסמיד-Gene-Gun. תלוי immunogenicity של האנטיגן, גבוה נוגדנים titres (עד 1:100,000 - 1:1,000,000) יכולה להיות מושגת רק אחרי אחת או 3-4 חיסונים דחיפה. בדרך כלל, תרנגולת מטילה ביצים ברציפות במשך כ -72 שבועות, לאחר מכן פוחתת יכולת הנחת. פרוטוקול זה מתאר את החילוץ של IgY הכולל חלמון ביצה באמצעות הליך משקעים (PEG. Polson et al. 1980). השיטה כוללת שני צעדים חשובים. הראשון הוא הסרת שומנים והשני הוא משקעים של IgY הכולל supernatant של צעד אחד. אחרי דיאליזה נגד חיץ (בדרך כלל PBS) IgY-לחלץ ניתן לאחסן -20 מעלות צלזיוס למשך יותר משנה. טוהר לחלץ הוא סביב 80%, את סך IgY לביצה נע בין 40-80 מ"ג, תלוי בגיל תרנגולת הנחת. תוכן הכולל IgY עולה עם הגיל של התרנגולת מן סביב 40 ​​מ"ג / ביצה עד 80 מ"ג / ביצה (ביחס PEG המשקעים). יכולת הנחת תרנגולת בשנה הוא כ 325 ביצים. כלומר, פוטנציאל יבול כולל של IgY גרם 20 שנה בסך הכל / מבוסס על תוכן IgY ממוצע של ביצה 60 מ"ג סה"כ IgY / (ראה לוח 1).

Protocol

1. פרוטוקול - IgY-מיצוי באמצעים של PEG-משקעים

איור. 1 נותן תרשים סכמטי של ההליך IgY-החילוץ (ראה טבלה 2). פרוטוקול תוארה לראשונה בשנת Polson et al. 1980.
כל הצעדים צריכים להתבצע באמצעות כפפות לטקס.

1. קליפת הביצה סדוקה בזהירות את החלמון מועבר "כפית חלמון" על מנת להסיר כמו ביצה לבנה הרבה האפשרית.
2. חלמון מועבר נייר מסנן והתגלגל להסיר הנותרים חלבון ביצה, ולאחר מכן העור חלמון הוא חתך עם ניתוח או מכשיר דומה (פיפטה קצה). החלמון הוא שפך לתוך שפופרת 50 מ"ל לבין נפח ביצה רשום (V1).
3. פעמיים חלמון ביצה נפח PBS מעורבב עם 6000 (ΣV1 + V2) חלמון לאחר מכן, PEG 3.5% (בשנת גרם, מרסקים) מהנפח הכולל הוא הוסיף vortexed, ואחריו 10 דקות מתגלגל על ​​מערבל מתגלגל. צעד זה של ההליך מיצוי מפרידה את ההשעיה בשני שלבים. אחת שלב מורכב "מוצקים חלמון וחומרים שומניים" (הציטוט המקורי של Polson et al. 1980) ושלב מימית המכילה חלבונים IgY אחרים.
4. הצינורות הם centrifuged על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות (10,000 סל"ד פי 13,000 XG, הרוטור Heraeus Multifuge 3SR, + זווית קבועה). Supernatant (V3) הוא שפך דרך פילטר מקופל הועבר צינור חדש.
5. 6000 PEG 8.5% בשנת גרם (מחושב לפי נפח חדש) מתווספים הצינור, vortexed והתגלגל על ​​מערבל מתגלגל כמו בשלב 3.
6. חזור על שלב 4 עם הבדל כי supernatant נמחקת.
7. גלולה היא מומס בזהירות באמצעות מקל זכוכית vortexer ב 1 מ"ל PBS. PBS מתווסף נפח סופי של 10 מ"ל (V4). הפתרון הוא מעורבב עם PEG 6000 12% (w / v, 1.2 גרם) ו כאל בשלב 3 (, מערבולת מערבל מתגלגל).
8. חזור על שלב 6 ו לפזר את גלולה בקפידה PBS 800 μl (מקל זכוכית מערבולת). חכו את בועות האוויר להיעלם ולאחר מכן להעביר (פיפטה) תמצית אל כמוסת דיאליזה. יש לשטוף את הצינורית עם 400 PBS μl ולהוסיף נפח למכשיר דיאליזה (V5). (להכנת התקנים דיאליזה ממברנות ראה נספח).
9. תמצית היא dialysed על הלילה מלח 0.1% (1600 מ"ל) ובחש בעדינות באמצעות stirrer מגנטי. למחרת בבוקר, מלוחים הוא הוחלף על ידי PBS ו dialysed לעוד שלוש שעות.
10. לאחר מכן IgY-לחלץ הוא משך מתוך הקפסולה דיאליזה על ידי טפטפת והועברו צינורות 2ml. הנפח הסופי הוא סביב מ"ל 2 (V6).
11. תכולת החלבון (מ"ג / מ"ל) של דגימות נמדד photometrically ב 280 ננומטר (01:50 מדולל PBS) וכן חושבו על פי חוק למברט-באר עם מקדם הכחדה של 1.33 עבור IgY (ראה איור. 2), איור . 4 מראה את איכות של התכשיר (טוהר התאוששות הם סביב 80%).
12. מומלץ לאחסן את דגימות aliquots ב -20 ° C (לא להקפיא את דגימות ב -70 ° C).
13. איכות בהכנות האחרונות מנותח על ידי פשוט SDS-PAGE כמתואר יופיטר פרוטוקול http:/www.jove.com/details.php?id=1916

2. נספח א ', לפני השימוש בשקית הדיאליזה חייבים להיות מוכנים באופן הבא על פי המלצות היצרן:

1. 20 שקיות דיאליזה נחתכים לחתיכות של 30 ס"מ, נתון בכוס זכוכית 2000 מ"ל.
2. 1750 מ"ל של 5 מ"מ EDTA-הפתרון מתווספים.
3. משפך זכוכית ממוקם מעל השקיות על מנת להבטיח כי שקיות מכוסים על ידי הפתרון EDTA. הפתרון הוא מחוממת מבושל דקות 5 (פלטה). הפתרון הוא יצק את שקיות נשטפים שלוש פעמים במים מזוקקים.
4. שוב 1750 מ"ל EDTA-הפתרון מתווספים, מבושל 5 דקות ושטף שלוש פעמים במים מזוקקים לעיל.
5. לבסוף השקיות דיאליזה הם מבושל 10 דקות במים מזוקקים ולאחסן ב 4 ° C. קח את שקיות הדיאליזה באמצעות פינצטה מעוקרים.

3. נציג תוצאות

באיור 1. תרשים סכמטי של מיצוי-IgY באמצעות משקעים פוליאתילן גליקול פי התיאור המקורי של Polson et al. 1980. כדי להציג תמונה מוגדלת לחץ כאן.

איור 2. פיתוח בסך הכל ב-IgY חלמון ביצה של תרנגולות לחסן התלות של גיל. בהינתן הוא אומר שבועי בסך IgY / ביצה ו SD (n = 4 תרנגולות מטילות). מ [פאולי et al. 2009]).

איור 3. Layiיכולת ניטור ng ארבע תרנגולות שחוסנו עם אנטיגנים שונים. החצים מצביעים על תאריך חיסון (מ [פאולי et al. 2009]). כדי להציג תמונה מוגדלת לחץ כאן.

איור 4. Polyacrylamide-Gelelectrophoresis ההכנות IgY בודדים ביצים שונים תחת צמצום התנאים
ליין 1 - סמן משקל מולקולרי, ליין 2 - IgY סטנדרטיים, ליין 3-5 - דגימות IgY שונים שהוכנו כמתואר בפרוטוקול. אלה ההכנות האחרונות על פי שלב 10 של פרוטוקול. HC - שרשראות כבדות, LC - chaines אור,? - זיהומים קלים המתאימים משקל מולקולרי סביב 35 kDa (כנראה שבר בטרמינל C-II של מבשר vitellogenin, [Klimentzou et al, 2006.]).

	עוף 21 (Antigen)	עוף 22 (Antigen)	עוף 19 (B Antigen)	עוף 23 (ג Antigen)
מספר ביצים (IgY סה"כ) 1, 2 שנות תקופה	625 (38 גרם)	626 (38 גרם)	545 (33 גרם)	608 (37 גרם)
ביצה מספר (IgY סה"כ), בשנה הראשונה	345 (20 גרם)	304 (16 גרם)	326 (18 גרם)	308 (17 גרם)
ביצה מספר (IgY סה"כ), בשנה השנייה	280 (18 גרם)	322 (21 גרם)	219 (15 גרם)	300 (20 גרם)
% של מקס. ביצה מספר גדול ככל האפשר (שנה ראשונה) 2	106	93	100	95
% של מקס. ביצה מספר גדול ככל האפשר (שנה שנייה)	86	99	67	92
מספר ביצים מעובדים	565	620	283	401

¹ כמות IgY הכולל מחושב על ידי הכפלת מספר ביצים לפי ערך ממוצע של 60 מ"ג חלבון ביצה על פי נתונים של תרשים 2.

² מקסימום. מספר הביצים אפשרי בשנה הוא 325 על פי מידע של המגדל.

טבלה 1. שנתיים הסטטיסטיקה של יכולת ההטלה של התרנגולות שחוסנו עם אנטיגנים שונים. הנחת קיבולת אחוזים לכל היותר ארבע תרנגולות לאחר חיסון עם אנטיגנים שונים, כמו גם את IgY-התוצאה במהלך שנתיים (ראה גם איור. 3), [פאולי et al. 2009]).

ביצה מס.	חן Nr. הנחת תאריך	V1 [מ"ל] חלמון	V2 [מ"ל] PBS	1. PEG prec. [ז]	כרך [מ"ל] לאחר	2. PEG prec. [ז]	גלולה	3. PEG prec. [ז]	גלולה	כרך [מ"ל]	חלבון מ"ג סה"כ / ml	חלבון הכולל תיקון מ"ג / מ"ל
			2xV1 ΣV1 + V2	3,5% [w / v] ΣV1 + V2	prec., centrif. סינון V3	8,5% [w / v] V3	מומס מ"ל PBS V4	12% [w / v] V4	מומסים מ"ל PBS V5	אחרי דיאליזה נגד PBS V6	A280/ml	A280/ml: 1.33
1	H293 / 22.10.	15	30 45	1.58	31	2.63	10	1.2	1.2	1.7	35.0	26.3
2	H293 / 23.10.	13	26 39	1.37	25	2.12	10	1.2	1.2	1.7	28.8	21.6

טבלה 2. הפרוטוקול למופת של PEG משקעים

Discussion

הבחירה של שיטת IgY מתאים טיהור מושפעת סולם של היטהרות (מעבדה או תעשייה), עלות יעילות, טכנולוגיה (ציוד מעבדה), ואת ההשפעה על הסביבה (ניהול פסולת). שיטות שונות להפקת IgY נסקרו בהרחבה על ידי דה Meulenaer & Huyghebaert (2001, לבדיקה לראות גם שאדה et al. 2005). באופן כללי, השיטות הללו ניתן לחלק לשלוש קבוצות עיקריות:

1. שיטות רטיבות: מעורבים אמוניום או נתרן סולפט, polyethyleneglycol (PEG), חומצה caprylic ו caragenean.
2. שיטות chromatographic: זיקה כרומטוגרפיה, כרומטוגרפיה מחליפי יונים, כרומטוגרפיה אינטראקציה הידרופובי, כרומטוגרפיה אינטראקציה thiophylic, ואת ג'ל סינון כרומטוגרפיה.
3. Ultrafiltration.

טוהר הכנה IgY יכול להיות מוגברת על ידי שילוב של שיטות, למשל, PEG משקעים ניתן לשלב עם זיקה כרומטוגרפיה. במקרים מסוימים, בהתאם ליישום הסופי, תמצית של מים IgY מספיקה כדי להשיג תוצאות טובות (אקיטה & Nakai 1993). על פי הניסיון שלנו, IgY-מדגם נקבל על ידי PEG-משקעים עבד טוב מאוד בהרבה מבחני החיסונית שונים. על ידי סטנדרטיזציה בשיטת PEG-משקעים עוזר אחד טכני הוא מסוגל לעבד כ 84 ביצים בשבוע, אשר מתאים בסכום של IgY הכולל בין 4 ל 7 גרם בשבוע. חישוב פשוט: הנחת תרנגולת הוא מחוסן עם אנטיגן. לאחר חיסונים להגביר כמה תרנגולת מייצר נוגדנים ספציפיים (AB) עם titre של 1:50,000, במשך תקופה של 30 ימים. 30 ביצים x 2 מ"ל IgY לחלץ (ראה פרוטוקול איור. 3) מתאים IgY 60 מ"ל הכולל, אשר בתורו המתאים דילול Ab-l של 3000 (את הקיבולת של הדלי הוא 10 ליטר), זה אומר עם אני 3000 הפתרון Ab 300 דליים יכול להיות מלא. לכן, לאור כמות כזו Ab-עצום אין בעיה לאחסן Ab-הבריכה של איכות סגוליות מתמיד. טכניקה זו מפחיתה את השתנות תשלום / הרבה נצפתה אחרת polyspecific Ab.

למרות ההיבט של כמות, IgY Ab יש יתרונות נוספים בהשוואה IgG יונקים: אין הפעלה של מערכת המשלים יונקים, לא תגובתיות צולבת עם HAMA (עכבר אנושי נוגדנים נגד), גורמים שגרונית או אדם קבוצה דם אנטיגנים (חוסר heteroagglutinins).

היתרון הבולט של IgY-Ab הוא המרחק שנקרא פילוגנטי. מרחק פילוגנטי הסיבה להבדלים המתואר לעתים קרובות בין ספציפיות Ab של יונקים ועופות, גם כאשר שחוסנו זהה. בנוסף ההבדלים בין יונקים את המערכת החיסונית העופות עצמם, הבדלים בפיתוח פילוגנטי אלה שני מעמדות בעלי חיים תורמת ספציפיות שונות Ab. מחברים אחדים דיווחו כי לעתים קרובות לייצר תרנגולות Abs נגד מבחינה פילוגנטית יונקים חלבונים או פפטידים שמור ביותר ביעילות רבה יותר מאשר לעשות ארנבים (לבדיקה לראות שאדה et א 2005). כתוצאה מכך, נשמרת אנטיגן יכול להישאר "רעולי פנים" למערכת החיסון ארנב, ובכך לגרום רק חלש או תגובה "שקט". יתר על כן, אם תרנגולות וארנבות הם שחוסנו עם האנטיגן יונקים אותו, לעתים קרובות התרנגולות להגיב עם סגוליות-Ab זה יכול להיות מושגת רק לעתים נדירות ארנבים. גם את ההיבט של רווחת בעלי חיים חשוב מאז Ab הם הלא פולשני מופק חלמון ביצה. בשילוב עם חיסון (הפלסמיד) Gene-Gun IgY הייצור הוא לגמרי לא פולשנית (ויטקובסקי et al. 2009).

לסיכום, את הייצור של Ab ב התרנגולות ואת IgY-מיצוי באמצעים של PEG-המשקעים היא מאוד חסכונית תוצאות Ab מאוד ספציפיות עם titres יציב עד 1:1,000,000. בשל המרחק בין פילוגנטי Aves ו יונקים, עופות מסוגלים לייצר Ab ספציפיים נגד אנטיגנים יונקים שמור ביותר לעומת ארנבים למשל. כמות יוצאת דופן של Ab מתקבל על ידי IgY הטכנולוגיה פותח את הדלת גם עבור שימוש IgY-Ab ברפואה אדם ולשימוש וטרינרי למטרות טיפוליות / מניעתי.

Materials