Tecnologia IgY: Estrazione di anticorpi pollo rosso d'uovo con polietilenglicole (PEG) Precipitazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive in particolare l'estrazione di IgY totale di tuorlo d'uovo per mezzo di precipitazione polietilene glicole e fornisce informazioni generali sulla tecnologia IgY.

Abstract

Galline possono essere immunizzati per mezzo di im vaccinazione (muscolo pettorale, a destra ea sinistra, volume di iniezione 0,5-1,0 ml) o per mezzo di Gene-Gun plasmide-immunizzazione. Dipende l'immunogenicità dell'antigene, alta anticorpi titoli (fino a 1:100.000 - 1:1.000.000) può essere raggiunto dopo solo uno o 3-4 vaccinazioni spinta. Normalmente, una gallina depone uova ininterrottamente per circa 72 settimane, dopo la diminuzione della capacità di posa. Questo protocollo descrive l'estrazione di IgY totale di tuorlo d'uovo per mezzo di una procedura di precipitazioni (PEG. Polson et al. 1980). Il metodo prevede due passi importanti. Il primo è la rimozione dei lipidi e il secondo è la precipitazione di IgY totale dal surnatante della fase uno. Dopo la dialisi contro un buffer (normalmente PBS) il IgY-estratto può essere conservato a -20 ° C per più di un anno. La purezza del estratto è circa l'80%, il totale per IgY uovo varia da 40-80 mg, dipende dall'età della gallina ovaiola. Il tenore totale di IgY aumenta con l'età della gallina da circa 40 mg / uovo fino a 80 mg / uovo (PEG relative precipitazioni). La capacità di posa di una gallina per anno è di circa 325 uova. Questo significa che un raccolto totale potenziale di 20 g IgY totale / anno sulla base di un contenuto IgY media di 60 mg uovo totale IgY / (vedi tabella 1).

Protocollo

1. Protocollo - IgY-estrazione con PEG-precipitazione

Fig. 1 riporta lo schema del IgY estrazione procedura (cfr. tabella 2). Il protocollo è stato descritto nel Polson et al. 1980.
Tutti i passaggi devono essere effettuate utilizzando guanti di lattice.

1. Il guscio è incrinato con cura e il tuorlo è trasferito in un "cucchiaio tuorlo" al fine di rimuovere come un uovo più bianco possibile.
2. Il tuorlo è trasferito in una carta da filtro e laminati per rimuovere restante albume, tuorlo poi la pelle è tagliata con un bisturi o uno strumento simile (puntale). Il tuorlo viene versato in un tubo da 50 ml e il volume dell'uovo è registrata (V1).
3. Il doppio del volume tuorlo d'uovo di PBS è mescolato con l'(ΣV1 + V2) tuorlo, dopo PEG 6000 del 3,5% (in grammi, polverizzati) del volume totale è aggiunto e in agitazione, seguiti da 10 minuti che rotola su un mixer di rotolamento. Questo passo della procedura di estrazione separa la sospensione in due fasi. Una fase consiste nel "solidi tuorlo e sostanze grasse" (citazione originale di Polson et al. 1980) e una fase acquosa contenente proteine ​​IgY e altri.
4. I tubi vengono centrifugati a 4 ° C per 20 min (10.000 rpm in base a 13.000 xg, Heraeus Multifuge 3SR +, rotore ad angolo fisso). Il supernatante (V3) è versato attraverso un filtro a pieghe e trasferito in una nuova provetta.
5. PEG 6000 8,5% in grammi (calcolato in base al nuovo volume), vengono aggiunti al tubo, in agitazione e arrotolato su un mixer a rotazione come nel punto 3.
6. Ripetere il punto 4 con la differenza che il supernatante viene scartato.
7. Il pellet viene accuratamente sciolto in 1 ml di PBS per mezzo di un bastoncino di vetro e il vortex. PBS viene aggiunto a un volume finale di 10 ml (V4). La soluzione è mescolata con 6000 PEG 12% (w / v, 1,2 grammi) e trattati come al punto 3 (vortice, mixer rotolamento).
8. Ripetere il passaggio 6 e sciogliere il precipitato con cura in 800 microlitri di PBS (bastone di vetro e vortex). Attendere che le bolle d'aria a scomparire e poi il trasferimento (pipetta) l'estratto di una capsula dialisi. Lavare il tubo con 400 microlitri di PBS e aggiungere il volume al dispositivo di dialisi (V5). (Per la preparazione di dispositivi di dialisi e le membrane vedi appendice).
9. L'estratto è dializzato durante la notte in soluzione salina 0,1% (1.600 ml) e delicatamente mescolato per mezzo di un agitatore magnetico. La mattina seguente, la salina, è sostituito dal PBS e dializzati per altre tre ore.
10. Successivamente, la IgY estratto è tirato dalla capsula dialisi da una pipetta e trasferito in provette 2 ml. Il volume finale è di circa 2 ml (V6).
11. Il contenuto di proteine ​​(mg / mL) dei campioni è misurata fotometricamente a 280 nm (1:50 diluito con PBS) e calcolato in base alla legge di Lambert-Beer con un coefficiente di estinzione di 1,33 per IgY (vedi fig. 2), Fig. . 4 mostra la qualità della preparazione (la purezza e il recupero sono circa l'80%).
12. Si consiglia di conservare i campioni in aliquote a -20 ° C (non congelare i campioni a -70 ° C).
13. La qualità della preparazione finale è analizzato da semplici SDS-PAGE, come descritto nel protocollo JOVE http:/www.jove.com/details.php?id=1916

2. Appendice-prima di usare il sacco a dialisi deve essere preparato nel modo seguente secondo le raccomandazioni del costruttore:

1. 20 sacchi dialisi vengono tagliate a pezzi di 30 cm e dato in un bicchiere di vetro 2000 ml.
2. 1.750 ml di 5 mm con EDTA soluzione vengono aggiunti.
3. Un imbuto di vetro è posto sopra i sacchetti per garantire che le borse sono coperti dalla soluzione di EDTA. La soluzione è riscaldata e bollito per 5 min (piastra calda). La soluzione è decantato e le borse sono lavati tre volte con acqua distillata.
4. Ancora una volta 1.750 ml con EDTA soluzione sono aggiunti, bolliti per 5 minuti e lavati tre volte con acqua distillata come sopra.
5. Infine le borse di dialisi vengono bolliti per 10 minuti in acqua distillata e conservato a 4 ° C. Estrarre le borse dialisi per mezzo di pinzette sterilizzate.

3. Rappresentante risultati

Figura 1. Schema di IgY-estrazione mediante precipitazione polietilene glicole secondo la descrizione originale di Polson et al. 1980. Per visualizzare l'immagine ingrandita clicca qui.

Figura 2. Sviluppo del totale-IgY nel tuorlo d'uovo di gallina immunizzati in dipendenza di età. Dato è la media settimanale del totale IgY / uovo e SD (n = 4 galline ovaiole). Da [Pauly et al. 2009]).

Figura 3. Layicapacità di controllo ng di quattro galline immunizzati con antigeni diversi. Le frecce indicano la data di vaccinazione (da [Pauly et al. 2009]). Per visualizzare un'immagine più grande clicca qui.

Figura 4. Poliacrilammide-elettroforesi in gel di preparati IgY individuali da uova diverse in condizioni riducenti
Corsia 1 - marcatore di peso molecolare, Lane 2 - IgY standard, Lane 3-5 - campioni IgY diverse preparato come descritto nel protocollo. Questi sono gli ultimi preparativi in ​​base al punto 10 del protocollo. HC - catene pesanti, LC - chaines luce,? - Impurità minore, corrispondente al peso molecolare di circa 35 kDa (probabilmente il frammento C-terminale del precursore vitellogenina II, [Klimentzou et al, 2006.]).

	Pollo 21 (Antigen A)	Pollo 22 (Antigen A)	Pollo 19 (B Antigen)	Pollo 23 (C Antigen)
Numero di uova (IgY totale) 1, 2 anni di periodo	625 (38 g)	626 (38 g)	545 (33 g)	608 (37 g)
Numero di uova (IgY totale), primo anno	345 (20 g)	304 (16 g)	326 (18 g)	308 (17 g)
Numero di uova (IgY totale), secondo anno	280 (18 g)	322 (21 g)	219 (15 g)	300 (20 g)
% Di max. numero possibile di uova (primo anno) 2	106	93	100	95
% Di max. uovo numero possibile (secondo anno)	86	99	67	92
numero di uova trattate	565	620	283	401

¹ La quantità di IgY totale viene calcolato moltiplicando il numero delle uova per un valore medio di 60 mg di proteina per uovo secondo i dati della Figura 2.

² La max. numero possibile di uova all'anno, si trova a 325 in base ad un informazione del selezionatore.

Tabella 1. Statistiche Due anni di capacità di deposizione delle uova di polli immunizzati con antigeni diversi. Posa capacità in percentuale del massimo di quattro galline dopo l'immunizzazione con antigeni diversi, come pure la IgY-risultato nel corso di due anni (vedi anche fig. 3), [Pauly et al. 2009]).

Uovo nr.	Nr. gallina. Posa Data	V1 [ml] tuorlo	V2 [ml] di PBS	1. PEG prec. [G]	Vol. [ml] dopo	2. PEG prec. [G]	Pallina	3. PEG prec. [G]	Pallina	Vol. [ml]	Proteine ​​totali mg / ml	Corretto proteine ​​totali mg / ml
			2xV1 ΣV1 + V2	3,5% [w / v] ΣV1 + V2	prec., centrif. e filtrazione V3	8,5% [w / v] V3	disciolti in ml V4 PBS	12% [w / v] V4	Sciolto in ml di PBS V5	Dopo la dialisi contro PBS V6	A280/ml	A280/ml: 1,33
1	H293 / 22.10.	15	30 45	1,58	31	2,63	10	1,2	1,2	1,7	35,0	26,3
2	H293 / 23.10.	13	26 39	1,37	25	2,12	10	1,2	1,2	1,7	28,8	21,6

Tabella 2. Protocollo esemplare di PEG precipitazioni

Discussione

La scelta di un metodo adeguato di purificazione IgY è influenzata dalla scala di purificazione (laboratorio o industriale), redditività, tecnologia (attrezzature di laboratorio), e l'impatto sull'ambiente (gestione dei rifiuti). Vari metodi di estrazione IgY sono state esaminate in dettaglio da De Meulenaer & Huyghebaert (2001, per una rassegna vedi anche Schade et al. 2005). In generale, questi metodi possono essere divisi in tre gruppi principali:

1. Metodi di precipitazione: coinvolgere solfato di ammonio o di sodio, polietilenglicole (PEG), acido caprilico e caragenean.
2. Metodi cromatografici: cromatografia di affinità, cromatografia a scambio ionico, cromatografia di interazione idrofobica, cromatografia di interazione thiophylic, gel-filtrazione e cromatografia.
3. Ultrafiltrazione.

La purezza di una preparazione IgY può essere aumentata con una combinazione di metodi, ad esempio, PEG precipitazione può essere combinato con cromatografia di affinità. In alcuni casi, a seconda dell'applicazione finale, un estratto di IgY acqua è sufficiente per ottenere buoni risultati (Akita & Nakai 1993). Secondo la nostra esperienza, il IgY-campione si ottiene con PEG-precipitazione ha lavorato molto bene in un sacco di diversi saggi immunologici. Uniformando i PEG-precipitazione metodo di un assistente tecnico è in grado di elaborare circa 84 uova a settimana, il che corrisponde ad un importo di IgY totale tra 4 e 7 grammi a settimana. Un semplice calcolo: una gallina ovaiola è immunizzati con un antigene. Dopo un paio di vaccinazioni aumentare la gallina produce anticorpi specifici (Ab) con un titolo di 1:50.000 durante un periodo di 30 giorni. 30 uova x 2 ml IgY estratto (vedi protocollo e fig. 3) corrisponde a 60 ml IgY totale, che a sua volta corrisponde ad un Ab-diluizione di 3.000 litri (la capacità di un secchio è di 10 l), questo significa che con 3.000 l della soluzione di Ab 300 secchi possono essere riempiti. Così, in vista di tale enorme quantità di Ab-non è un problema di memorizzare un Ab-piscina di qualità costante e specificità. Questa tecnica riduce il carico / lotto altrimenti variabilità osservata in polispecifico Ab.

Nonostante l'aspetto della quantità, IgY Ab hanno ulteriori vantaggi rispetto ai mammiferi IgG: Nessuna attivazione del sistema del complemento mammiferi, nessun cross-reattività con HAMA (umano anticorpo di topo anti), fattori reumatoidi o umano antigeni del gruppo sanguigno (mancanza di heteroagglutinins).

Un vantaggio eccezionale di IgY-Ab è la cosiddetta distanza filogenetica. Distanza filogenetica è la ragione per le differenze spesso descritto tra le specificità Ab dei mammiferi e dei polli, anche se in modo identico immunizzati. Oltre alle differenze tra i mammiferi e il sistema immunitario aviaria se stessi, le differenze di sviluppo filogenetico in queste due classi di animali contribuisce alla specificità diverse Ab. Diversi autori hanno riportato che i polli spesso producono Abs contro filogeneticamente proteine ​​altamente conservate mammiferi o peptidi in modo più efficiente di quanto non facciano i conigli (per una rassegna vedi Schade et a. 2005). Di conseguenza, un antigene conservato può rimanere "mascherato" per il sistema immunitario coniglio, e quindi causare solo un debole o una risposta "silenziosa". Inoltre, se polli e conigli sono immunizzati con lo stesso antigene mammiferi, molto spesso i polli rispondere con un Ab-specificità che raramente possono essere raggiunti in conigli. Anche l'aspetto del benessere degli animali è importante in quanto la Ab non invasiva estratto da tuorlo d'uovo. In combinazione con Gene-Gun (plasmide) l'immunizzazione IgY-produzione è completamente non invasivo (Witkowski et al. 2009).

In conclusione, la produzione di Ab in galline e il IgY-estrazione con PEG-precipitazione è molto conveniente e risulta in Ab altamente specifico con titoli stabile fino a 1:1.000.000. A causa della distanza filogenetica tra Aves e Mammalia, pollo sono in grado di produrre Ab specifici contro gli antigeni altamente conservato mammiferi in contrasto con i conigli per esempio. La straordinaria quantità di Ab ottenuto IgY tecnologia apre le porte anche per l'utilizzo IgY-Ab nella medicina umana e veterinaria per scopi terapeutici / profilattico.

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