Tecnología IgY: Extracción de anticuerpos de pollo de yema de huevo por el polietilenglicol (PEG) Precipitación

Resumen

Este protocolo describe en particular la extracción de IgY total de yema de huevo por medio de precipitación con polietilenglicol y ofrece información general acerca de la tecnología IgY.

Resumen

Las gallinas pueden ser inmunizados a través de im vacunación (Musculus pectoral izquierda y derecha, el volumen de inyección de 0,5-1,0 ml) o por medio de la Gene-Gun plásmido de la vacunación. Depende de la inmunogenicidad de los antígenos, anticuerpos altos títulos (hasta 1:100.000 - 1:1.000.000) se puede lograr después de sólo uno o 3-4 vacunas impulso. Normalmente, la gallina de los huevos de forma continua durante aproximadamente 72 semanas, a partir de entonces la imposición de reducciones de capacidad. Este protocolo describe la extracción de IgY total de yema de huevo por medio de un procedimiento de precipitación (PEG. Polson et al. 1980). El método consiste en dos pasos importantes. El primero es la eliminación de los lípidos y el segundo es la precipitación de la IgY total del sobrenadante de un solo paso. Después de la diálisis contra un tampón (normalmente PBS) de la IgY a extraer puede ser almacenado a -20 ° C durante más de un año. La pureza del extracto es de alrededor de 80%, el total de IgY por huevo varía de 40-80 mg, dependiendo de la edad de la gallina ponedora. El incremento total de IgY contenido con la edad de la gallina de alrededor de 40 mg / huevo hasta 80 mg / huevo (en relación con PEG precipitaciones). La capacidad de colocación de una gallina por año es de alrededor de 325 huevos. Eso significa una cosecha total potencial de 20 g IgY total / año en base a un contenido de IgY media de 60 mg total de IgY de huevos / (ver Tabla 1).

Protocolo

1. Protocolo - IgY-extracción por medio de la precipitación con PEG-

Fig. 1 ofrece un diagrama del procedimiento de extracción de IgY (ver Tabla 2). El protocolo fue descrito por primera vez en Polson et al. 1980.
Todos los pasos deben realizarse utilizando guantes de látex.

1. La cáscara del huevo es cuidadosamente agrietada y la yema se transfiere a una "cuchara de yema" con el fin de eliminar la mayor cantidad de huevos blancos como sea posible.
2. La yema se transfiere a un papel de filtro y rodó a eliminar los restantes clara de huevo, la yema se corta la piel con una lanceta o un instrumento similar (pipeta). La yema se vierte en un tubo de 50 ml y el volumen del huevo está registrado (V1).
3. El doble del volumen de yema de huevo de PBS se mezcla con la yema de huevo (ΣV1 + V2), después de PEG 6000 al 3,5% (en gramos, pulverizada) del volumen total se agrega y se agitaron, seguido de 10 minutos rodando sobre una mesa de mezclas de laminación. Ese paso del procedimiento de extracción se separa de la suspensión en dos fases. Una fase consiste en "sólidos en la yema y sustancias grasas" (cita original de Polson et al. 1980) y una fase acuosa que contiene las proteínas IgY y otros.
4. Los tubos se centrifuga a 4 ° C durante 20 minutos (10.000 rpm a 13.000 xg de acuerdo, Heraeus Multifuge 3SR +, rotor de ángulo fijo). El sobrenadante (V3) se vierte a través de un filtro de pliegues y se transfiere a un tubo nuevo.
5. 8,5% de PEG 6000 en gramos (calculado de acuerdo con el nuevo volumen) se añaden al tubo, vortex y rodó por un mezclador móvil como en el paso 3.
6. Repita el paso 4 con la diferencia que se desecha el sobrenadante.
7. El pellet es cuidadosamente disuelto en 1 ml de PBS por medio de una varilla de vidrio y el vórtice. PBS se añade a un volumen final de 10 ml (V4). La solución se mezcla con PEG 6000 al 12% (w / v, 1,2 gramos) y se trata como en el paso 3 (vortex, mezclador de rodadura).
8. Repita el paso 6 y disolver el precipitado con cuidado en 800 l de PBS (varilla de vidrio y agitar). Espere a que las burbujas de aire a desaparecer y luego transferir (pipeta) el extracto de una cápsula de diálisis. Enjuague el tubo con 400 l de PBS y añadir el volumen de la máquina de diálisis (V5). (Para la preparación de dispositivos de diálisis y de las membranas véase el apéndice).
9. El extracto se dializó durante la noche en el 0,1% de solución salina (1.600 ml) y se agita suavemente por medio de un agitador magnético. A la mañana siguiente, la solución salina se sustituye por PBS y se dializó durante otras tres horas.
10. Posteriormente, la IgY-extracto sacado de la cápsula de diálisis por una pipeta y se transfirió a tubos de 2 ml. El volumen final es de alrededor de 2 ml (V6).
11. El contenido de proteína (mg / mL) de las muestras se mide fotométricamente a 280 nm (1:50 diluido en PBS) y se calcula de acuerdo con la ley de Lambert-Beer, con un coeficiente de extinción de 1,33 para el de IgY (ver fig. 2), Fig. . 4 muestra la calidad de la preparación (la pureza y la recuperación son alrededor del 80%).
12. Es recomendable almacenar las muestras en alícuotas a -20 ° C (no congelar las muestras a -70 ° C).
13. La calidad de los preparativos finales se analiza mediante una simple SDS-PAGE como se describe en el protocolo JoVe http:/www.jove.com/details.php?id=1916

2. Apéndice antes de usar la bolsa de diálisis debe estar preparado de la siguiente manera de acuerdo a las recomendaciones del fabricante:

1. 20 bolsas de diálisis se cortan en trozos de 30 cm y la da en un vaso de vidrio de 2000 ml.
2. 1.750 ml de una mM EDTA 5-solución se agregan.
3. Un embudo de vidrio se coloca por encima de las bolsas para asegurarse de que las bolsas están cubiertos por la solución de EDTA. La solución se calienta y se hierve durante 5 minutos (placa caliente). La solución se decanta y las bolsas se lavan tres veces con agua destilada.
4. Una vez más, 1.750 ml de solución EDTA se agregan, se hierve durante 5 minutos y se lavan tres veces con agua destilada que el anterior.
5. Finalmente las bolsas de diálisis se hierven durante 10 minutos en agua destilada y se almacenan a 4 ° C. Saque las bolsas de diálisis por medio de pinzas esterilizadas.

3. Los resultados representativos

Figura 1. Esquema de IgY-extracción por medio de precipitación con polietilenglicol de acuerdo a la descripción original de Polson et al. 1980. Para ver una imagen más grande, haga clic aquí.

Figura 2. Desarrollo del total-IgY en la yema de huevo de gallinas inmunizadas en la dependencia de la edad. Teniendo en cuenta es la media semanal del total de IgY / huevo y el SD (n = 4 gallinas ponedoras). A partir de [Pauly et al. 2009]).

Figura 3. Layicapacidad de control ng de cuatro gallinas inmunizadas con antígenos diferentes. Las flechas indican la fecha de vacunación (de [Pauly et al. 2009]). Para ver una imagen más grande, haga clic aquí.

Figura 4. Poliacrilamida-electroforesis en gel de los preparativos IgY individuales a partir de huevos diferentes condiciones reductoras
Carril 1 - Marcador de peso molecular, Carril 2 - IgY-estándar, Lane 05.03 - las diferentes muestras IgY preparado como se describe en el protocolo. Estos son los últimos preparativos de acuerdo con el paso 10 del protocolo. HC - cadenas pesadas, LC - CHAINES luz? - Impurezas menores correspondiente al peso molecular alrededor de 35 kDa (probablemente el fragmento C-terminal de la vitelogenina precursor II, [Klimentzou et al, 2006.]).

	Pollo 21 (un antígeno)	Pollo 22 (un antígeno)	Pollo 19 (B antígeno)	Pollo 23 (C antígeno)
El número de huevos de gallina (IgY total) 1, 2 años de período	625 (38 g)	626 (38 g)	545 (33 g)	608 (37 g)
Huevo número (IgY total), el primer año	345 (20 g)	304 (16 g)	326 (18 g)	308 (17 g)
Huevo número (IgY total), el segundo año	280 (18 g)	322 (21 g)	219 (15 g)	300 (20 g)
% Del máximo. el número de huevos posibles (primer año) 2	106	93	100	95
% Del máximo. el número de huevos posibles (segundo año)	86	99	67	92
número de huevos procesados	565	620	283	401

¹ La cantidad de IgY total se calcula multiplicando el número de huevos por un valor medio de 60 mg de proteína por huevo de acuerdo a los datos de la Figura 2.

^{2 the} Max. el número de huevos posible por año es de 325 de acuerdo con una información del obtentor.

Tabla 1. Dos años de estadísticas de la capacidad de puesta de huevos de gallinas inmunizadas con antígenos diferentes. Acostado en la capacidad por ciento del máximo de cuatro gallinas después de la vacunación con antígenos diferentes, así como el resultado IgY-durante dos años (véase también la fig. 3), [Pauly et al. 2009]).

N º de huevos.	Hen N º. Fecha de puesta	V1 [ml] yema	V2 [ml] PBS	1. PEG prec. [G]	Vol [ml] después de	2. PEG prec. [G]	Bolita	3. PEG prec. [G]	Bolita	Vol [ml]	Proteínas totales mg / ml	Proteína total corregido mg / ml
			2xV1 ΣV1 + V2	3,5% [w / v] ΣV1 + V2	prec., Centrif. y la filtración V3	8,5% [w / v] V3	disuelto en PBS ml V4	12% [w / v] V4	Disuelto en PBS ml V5	Después de la diálisis contra PBS V6	A280/ml	A280/ml: 1,33
1	H293 / 22.10.	15	30 45	1.58	31	2.63	10	1.2	1.2	1.7	35.0	26.3
2	H293 / 23.10.	13	26 39	1.37	25	2.12	10	1.2	1.2	1.7	28.8	21.6

Tabla 2. Protocolo ejemplar de PEG precipitaciones

Discusión

La elección de un método de purificación de IgY adecuado es influenciado por la escala de purificación (de laboratorio o industrial), la rentabilidad, la tecnología (equipos de laboratorio), y el impacto sobre el medio ambiente (gestión de residuos). Diferentes métodos de extracción de IgY se han revisado en detalle por De Meulenaer y Huyghebaert (2001, para una revisión ver también Schade et al. 2005). En general, estos métodos se pueden dividir en tres grupos principales:

1. Métodos de precipitación: la participación de sulfato de amonio o de sodio, polietilenglicol (PEG), el ácido caprílico y caragenean.
2. Los métodos cromatográficos: cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de interacción thiophylic, y la cromatografía de filtración en gel.
3. Ultrafiltración.

La pureza de un preparado de IgY puede ser aumentado por una combinación de métodos, por ejemplo, la precipitación con PEG se puede combinar con la cromatografía de afinidad. En algunos casos, dependiendo de la aplicación final, un extracto de agua de la IgY es suficiente para lograr buenos resultados (Akita y Nakai, 1993). De acuerdo con nuestra experiencia, la IgY de la muestra se obtiene por la precipitación con PEG-funcionó muy bien en un montón de diferentes ensayos inmunológicos. Al estandarizar el método de precipitación con PEG-un asistente técnico es capaz de procesar aproximadamente 84 huevos por semana, lo que corresponde a una cantidad de IgY total entre 4 y 7 g por semana. Un simple cálculo: una gallina ponedora está inmunizado con un antígeno. Después de un impulso pocas vacunas de la gallina produce anticuerpos específicos (Ab) con un título de 1:50.000 durante un período de 30 días. 30 huevos x 2 ml de extracto de IgY (véase el protocolo y la figura. 3) corresponde a 60 ml IgY total, que a su vez corresponde a un Ab-dilución de 3.000 l (la capacidad de un cubo es de 10 l), es decir, con 3.000 l de la solución de Ab 300 cubos se pueden llenar. Por lo tanto, en vista de tan enorme cantidad de Ab-no es un problema de almacenar un Ab-piscina de calidad constante y la especificidad. Esta técnica reduce la variabilidad de carga / mucho de lo contrario observado en poliespecífico Ab.

A pesar del aspecto de la cantidad, la IgY Ab tienen más ventajas en comparación con los mamíferos IgG: No activación del sistema de complemento mamífero, sin reactividad cruzada con HAMA (anticuerpos humanos anti-ratón), el factor reumatoide o los antígenos de grupo sanguíneo (falta de heteroagglutinins).

Una ventaja sobresaliente de IgY-Ab es la distancia filogenética llamada. Distancia filogenética es la razón de las diferencias describe con frecuencia entre las especificidades Ab de mamíferos y aves, aunque de forma idéntica inmunizados. Además de las diferencias entre los mamíferos y el sistema inmunitario aviar sí mismos, las diferencias en el desarrollo filogenético de estas dos clases de animales contribuye a las diferentes especificidades Ab. Varios autores han reportado que los pollos a menudo producen Acs contra filogenéticamente muy conservadas proteínas o péptidos de mamíferos más eficientemente que los conejos (para revisión ver Schade et a. 2005). Como consecuencia, un antígeno conservado puede permanecer "oculta" para el sistema inmune de conejo, y por lo tanto la única causa una debilidad o una respuesta "en silencio". Además, si los pollos y los conejos son inmunizados con el antígeno de mamíferos mismo, muy a menudo los pollos responden con un Ab-especificidad que rara vez se puede lograr en los conejos. También el aspecto de la protección de los animales es importante ya que el Ab son de forma no invasiva extraída de la yema de huevo. En combinación con (plásmido) Gene-Gun de vacunación del IgY-producción es completamente no invasivo (Witkowski et al. 2009).

En conclusión, la producción de Ab en las gallinas y la extracción de IgY-por medio de PEG-precipitación es muy rentable y los resultados de Ab muy específicas con títulos estables hasta 1:1.000.000. Debido a la distancia filogenética entre Aves y Mamíferos, pollo son capaces de producir Ab específica contra los antígenos altamente conservados de mamíferos, en contraste con los conejos, por ejemplo. La extraordinaria cantidad de Ab obtenidos por la tecnología IgY-abre la puerta también para el uso de IgY-Ab en la medicina humana y veterinaria con fines terapéuticos y / o profiláctico.

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