从人类毛囊神经嵴干细胞的分离和培养的

摘要

本文提出了一种强大的协议从人的头发毛囊的神经嵴干细胞的分离和培养。

摘要

毛囊进行终身的增长，头发的周期是一个控制的过程，涉及干细胞的增殖和平静。头发隆起是一个很好的成体干细胞的特征利基。这包含了许多不同类型的干细胞，包括上皮干细胞^，黑素细胞的干细胞³和神经嵴类似干细胞^4-7段的外根鞘。毛囊代表一个可访问的和不同类型的人类干细胞的丰富来源。我们和其他人隔离的神经嵴干细胞（非公务员合约员工）的成人和胎儿毛囊^4,5。这些人类干细胞标记的滞留细胞，通过体外细胞不对称分裂，并能够自我更新。他们表示，未成熟的神经嵴细胞的标记物，但不分化标志物。我们的表达谱的研究表明，他们有着相似的基因表达模式与小鼠皮肤未成熟的神经创建ST细胞。它们表现出的克隆的多能在体外克隆单细胞培养后，可以给引起生肌，黑色素细胞和神经元的细胞谱系。分化的细胞，不仅获得了种系特异性标志物，而且在体外条件下表现出适当的功能。此外，这些非公务员合约员工向间充质谱系分化潜能。分化的神经元细胞能坚持在小鼠大脑和保留神经元的分化。它已经表明，毛囊派生的非公务员合约员工可以帮助神经再生，改善运动功能，这些干细胞在小鼠体内移植后，横断性脊髓损伤^8。此外，外周神经干细胞移植和植入的皮肤源性坐骨神经神经前体细胞相邻修复，导致髓鞘^10。因此，毛囊/皮肤派生的非公务员合约员工已经显示出可喜的结果为r临床前模型egenerative治疗。

体细胞重编程诱导多能干细胞（iPS细胞）已经显示出巨大的潜力，再生医学。不过，也有iPS细胞，特别是基因/病毒整合和潜在的致瘤性多能干细胞的长期影响仍有许多问题没有得到充分解决。还有许多难以克服的障碍前iPS细胞可用于再生医学。鉴于成体干细胞是已知的，是安全的，它们已被用于临床多年，如骨髓移植。很多病人已经从治疗中获益。自体成人干细胞仍然是优选的用于移植细胞。因此，在人的皮肤/头发毛囊容易获得的，可扩展的成体干细胞是再生医学的重要来源。

研究方案

1。组织培养板的制备

1. 外套的各孔具有足够的聚-D-赖氨酸（PDL），以覆盖的井的底部。允许板在通风橱中干燥。
2. 井干后，用无菌水冲洗，并吸。允许板在通风橱中干燥。
3. 当干燥时，纤连蛋白涂层（BioWhittaker公司水溶解于在37℃下过夜，在6毫升的浓度为1毫克）。
4. 添加非公务员合约介质[95毫升DMEM/F12，1毫升佩恩/链霉素（P / S），1毫升N2，B272毫升，100μl的巯基乙醇（2ME; 50mM的股票），碱性成纤维细胞生长因子（20 ng / ml的培养基），胰岛素样生长因子-1（20纳克/毫升培养基）和EGF（20 ng / ml的培养基中）]之前，纤连蛋白的板在干

2。提取人的头皮上的毛囊细胞

1. 在启动的过程中分离的非公务员合约之前，需要准备各自的媒体和试剂（ 见表1）。
2. 新鲜成人头皮换装程序或fe河谷头皮组织，收集含有青霉素 - 链霉素的PBS洗涤。
3. 皮肤，然后转移到50ml试管，并与中性蛋白酶（10毫克/毫升）过夜培养在DMEM中，在4℃下在37°C培养2-4小时也有效。皮片应该是一个最大宽度为1厘米，以使酶渗透。
4. 皮肤进入一个消毒的培养皿中转移，拉每根毛发从皮肤上抓头发轴靠近皮肤表面，紧紧拉住顺利。毛囊显示形态的任一生长期（ 图1A）或休止期（ 图1B）。
5. 孤立卵泡片段孵育15-20分钟，在室温下振荡定期在0.05％胰蛋白酶-EDTA（Invitrogen）中，添加有10％FBS的DMEM4毫升停止反应。滤泡上皮细胞被胰蛋白酶消化，并通过40微米的过滤器过滤，以获得含有不同大小和形状的细胞的单细胞悬液。
6. 纺在200×g离心5分钟，弃去上清液小心，重新悬浮于1ml PBS含有2％血清（FBS）。
7. 另外，弹拨的毛囊可以放置在文化，没有胰蛋白酶消化长出的头发在原地领域。

3。使用流式细胞仪检测细胞分选分离毛囊非公务员合约员工

1. 毛囊的单细胞悬浮液的胰蛋白酶消化，并通过以下方式获得标记的抗CD271（APC共轭）号/ HNK1（FITC标记的）或CD271 / alpha4整合（PE共轭的）在黑暗中在冰上40分钟。
2. 在室温下在200×g离心5分钟离心，吸出上清液。
3. 在PBS中含有2％血清（FBS），重悬细胞之前，排序，PI被添加到栅极，满分的死细胞。
4. 用流式细胞仪（FACS）进行细胞分选。收集CD271 +，HNK1 +双阳性细胞或CD271 +，alpha4整合+双阳性细胞（ 图2）。
5. 排序后ING，CD271 +，HNK1 +双阳性细胞或CD271 +，alpha4整合+双阳性细胞培养在超低的附件板的非公务员合约雇员的介质中

4。主要非公务员合约员工文化

1. 文化脱离滤泡细胞或FACS排序的细胞在超低的附件板中的非公务员合约雇员的介质，改变介质的每一天。
2. 每天在显微镜下检查细胞培养。非公务员合约员工将开始形成浮动小团聚几天后，和良好的领域，在2-5周的文化，根据年龄的捐助者（ 图3A）。副产物会出现在几天内在隆起区域时，整个毛囊的非公务员合约雇员的介质中培养良好的领域在几个星期内原位 （ 图3B）。

5。扩展的非公务员合约员工

1. 用PBS洗涤细胞一次。
2. 加入预温（37°C，关键）accutase和孵化，在37°C 5-10分钟周期性振荡，使确定的神经干细胞球，解离成单细胞（附着培养非公务员合约，孵育与accutase细胞在37℃下5分钟，以使确保毛囊干细胞的分离）。
3. 洗净离心细胞两次在DMEM/F12培养基在室温下在200×g离心5分钟以除去任何剩余accutase溶液。
4. 与非公务员合约雇员的培养基重新悬浮细胞。
5. 对于浮动文化，​​将细胞在超低的附件板。对于贴壁培养，将细胞预处理细胞培养板。

6。代表性的成果

非公务员合约培养基是足以维持在未分化的状态，而不需要为饲养细胞hNCSCs。角质形成细胞不能增殖，并在介质中逐渐死亡。某些小圆形细胞增生，形成小聚集在暂停后3〜5天。这些漂浮聚集慢慢增加我n大小，生成的三维球体状的结构，我们称之为毛球（ 图3A）。如果涂层板中培养，非公务员合约员工将附着在表面，不形成任何领域。附加的非公务员合约员工成长的速度比悬浮液中。球体形成或连接的干细胞表达非公务员合约标记。当整个毛囊文化，球体形成的凸起区域对应的区域（ 图3B）。

图1。弹拨生长期（A）和休止期（B）毛囊。

图2。代表性的图像流式细胞仪分析的非公务员合约员工。左图：门控使用的抗CD271和抗alphe的的整合素细胞。右面板：使用反CD271和抗HNK1的抗体，细胞门控。

图3。形态的头发球。（B）（A）形态的，浮毛球，左侧面板：低功耗，右图：高功率。在隆起区域，左侧面板：在休止期的头发球凸出的毛球原位形态，右侧面板：在隆起区域的生长期毛囊的头发球。

讨论

细胞的分离和培养方法的重现性和强大的。我们已经生成的非公务员合约员工从几十个人在广泛的年龄范围。虽然这是最好的，处理组织组织收获后，我们发现头皮组织可以安全地存储在媒体上冰过夜运输对细胞活力的影响最小。

重要的是要与抗生素治疗头皮组织和毛囊分离过程中使用无菌技术，以避免潜在的微生物污染。被丢弃的小改款皮肤或胎儿头皮组织的收益率，数?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965-092
DMEM/F12	Invitrogen	11330-32
Heat-inactivated FBS	Hyclone	SH30071.03
B27 supplement	Invitrogen	17504044
N2 supplement	Invitrogen	17502048
bFGF	Invitrogen	PHG0026
EGF	R&D system	236-EG-01M
IGF-I	R&D system	291-G1-050
0.05% Trypsin/EDTA	Invitrogen	25300-054
Dispase	Invitrogen	17105041
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15070063
Table 1.