Isolement et culture des cellules souches neurales Crête des follicules pileux humains

Résumé

Cet article présente un protocole robuste pour l'isolement et la culture des cellules souches neurales de crête des follicules pileux humains.

Résumé

Les follicules pileux subissent une croissance continue et le cycle de cheveux est un processus bien contrôlé impliquant la prolifération des cellules souches et la quiétude. Renflement de cheveux est un créneau bien caractérisé pour les cellules souches adultes ^1. Ce segment de la gaine épithéliale externe contient un certain nombre de différents types de cellules souches, notamment les cellules souches épithéliales ^2, les cellules souches de mélanocytes ³ ​​et crête neurale comme les cellules souches ^4-7. Les follicules pileux sont une source accessible et riche pour les différents types de cellules souches humaines. Nous et d'autres avons isolé des cellules souches neurales de crête (SNCLC) de follicules pileux humains fœtaux et adultes ^4,5. Ces cellules souches humaines sont des cellules de retenue de l'étiquette et qui sont capables de s'auto-renouveler par division cellulaire asymétrique in vitro. Ils expriment des marqueurs de cellules neurales immatures mais pas de crête marqueurs de différenciation. Notre étude a montré que le profil d'expression qu'ils partagent le même profil d'expression génique similaire avec murin peau immature création de neuronescellules st. Ils présentent multipotence clonale qui peuvent donner lieu à des lignées de cellules myogéniques, mélanocytaire et neuronale après in vitro de culture cellulaire clonale unique. Les cellules différenciées non seulement acquérir la lignée des marqueurs spécifiques, mais aussi la démonstration de fonctions appropriées dans des conditions ex vivo. En outre, ces SNCLC montrer le potentiel de différenciation vers lignées mésenchymateuses. Différenciées des cellules neuronales peuvent persister dans le cerveau de souris et de conserver les marqueurs de différenciation neuronale. Il a été montré que les dérivés SNCLC follicule pileux peut aider à la repousse nerveuse, et ils améliorent la fonction motrice chez les souris transplantées avec des cellules souches à la suite de ces lésions de la moelle épinière sectionnant ^8. En outre, les nerfs périphériques ont été réparés avec des greffes de cellules souches ^9, et l'implantation de cellules précurseurs provenant de la peau adjacente à écraser les nerfs sciatiques a abouti à la remyélinisation ^10. Par conséquent, les follicules pileux de la peau / SNCLC dérivés ont déjà montré des résultats prometteurs pour rthérapie egenerative dans des modèles précliniques.

Reprogrammation de cellules somatiques à des souches pluripotentes (iPS) a montré un énorme potentiel pour la médecine régénérative. Cependant, il ya encore beaucoup de problèmes avec les cellules iPS, en particulier l'effet à long terme de l'oncogène / virus intégration et tumorigénicité potentielle de cellules souches pluripotentes n'ont pas été traitées de manière adéquate. Il existe encore de nombreux obstacles à surmonter avant que les cellules iPS peuvent être utilisés pour la médecine régénérative. Alors que les cellules souches adultes sont connus pour être en sécurité et ils ont été utilisés en clinique depuis de nombreuses années, comme la greffe de moelle osseuse. Beaucoup de patients ont déjà bénéficié de ce traitement. Autologues de cellules souches adultes sont toujours les cellules préférées pour la transplantation. Par conséquent, les cellules facilement accessibles et extensible souches adultes dans la peau de l'homme / les follicules pileux sont une source précieuse pour la médecine régénérative.

Protocole

1. Préparation des plaques de culture tissulaire

1. Manteau chaque puits avec suffisamment de Poly-D-Lysine (PDL) pour couvrir le fond du puits. Laisser les plaques à sécher dans la hotte.
2. Après les puits sont à sec, rincez avec de l'eau stérile et aspirer. Laisser les plaques à sécher dans la hotte.
3. Une fois sec, le manteau avec de la fibronectine (qui a été dissous dans de l'eau Biowhittaker une nuit à 37 ° C, à une concentration de 1 mg dans 6 ml).
4. Ajouter à moyen NCSC [95 ml DMEM/F12, 1 ml Penn / Strep (P / S), 1 ml N2, 2 ml B27, 100 ul mercaptoéthanol (2ME, 50 mm stock), le bFGF (20 ng / ml de milieu), l'IGF -1 (20 ng / ml de milieu) et l'EGF (20 ng / ml de milieu)] avant la fibronectine sec dans les assiettes,

2. Extrait cellules du follicule pileux du cuir chevelu de l'homme

1. Avant de commencer la procédure d'isolement SNCLC, il faut préparer les médias respectifs et des réactifs (voir tableau 1).
2. Frais peau d'un adulte cuir chevelu humain des procédures lifting ou feles tissus du cuir chevelu tal est recueilli, lavé avec du PBS contenant de la pénicilline-streptomycine.
3. La peau est ensuite transféré dans des tubes de 50 ml et incubées dans du DMEM avec Dispase (10 mg / ml) pendant une nuit à 4 ° C. Incubation pendant 2-4 heures à 37 ° C est également efficace. Morceaux de peau doit être d'une largeur maximale de 1 cm pour permettre une enzyme de pénétrer.
4. Transférer la peau dans un plat de Pétri stérilisées; arracher chaque poil de la peau en saisissant la tige du cheveu près de la surface de la peau et en tirant fermement et en douceur. Les follicules pileux présenter une morphologie soit anagène (figure 1A) ou télogène (figure 1B).
5. Incuber les fragments follicule isolés dans 0,05% de trypsine-EDTA (Invitrogen) pendant 15-20 min à température ambiante sous agitation périodique, ajouter 4 ml de DMEM avec 10% de FBS pour arrêter la réaction. L'épithélium folliculaire est la trypsine et filtré à travers 40 um filtre pour obtenir une suspension à cellule unique contenant des cellules de taille variable et de forme.
6. Tournerà 200 xg pendant 5 min, éliminer le surnageant avec précaution, remettre en suspension dans 1 ml de PBS contenant 2% de sérum (FBS).
7. En variante, les follicules pileux épilé peuvent être mises en culture sans digestion par la trypsine à croître sphères cheveux in situ.

3. Isolement du SNCLC follicule pileux Utilisation Cell Sorting cytométrie en flux

1. Follicule pileux suspension à cellule unique sont obtenus par digestion par la trypsine et étiquetées avec des anticorps contre CD271 (APC-conjugué) / HNK1 (conjugué au FITC) ou CD271 / alpha4 intégrine (PE-conjugué) pendant 40 minutes sur de la glace dans l'obscurité.
2. Centrifuger pendant 5 min à 200 xg à température ambiante et aspirer le surnageant.
3. Resuspendre les cellules dans du PBS contenant 2% de sérum (FBS), et avant le tri, le PI est ajoutée à la porte les cellules mortes.
4. Effectuer le tri cellulaire par cytométrie en flux (FACS). Recueillir CD271 +, + HNK1 cellules doublement positives ou CD271 +, alpha4 intégrine + cellules doublement positives (figure 2).
5. Après sortetion, CD271 +, + HNK1 cellules doublement positives ou CD271 +, alpha4 intégrines + doubles cellules positives sont mises en culture dans des plaques de fixation ultra-faible à moyen NCSC

4. Culture du SNCLC primaires

1. Culture des cellules folliculaires dissociées ou FACS des cellules triées dans des plaques de fixation ultra-faible dans le milieu NCSC, changer moyenne chaque jour.
2. Vérifiez tous les jours de culture cellulaire au microscope. SNCLC va commencer à former de petits agrégats flottants après plusieurs jours et bien formés de sphères dans 2-5 semaines dans la culture en fonction de l'âge des donateurs (figure 3A). Excroissance apparaîtra dans quelques jours à la région renflement et bien formés in situ dans les sphères plusieurs semaines (figure 3B) lorsque les follicules pileux entiers sont cultivées dans le milieu NCSC.

5. Expansion du SNCLC

1. Laver les cellules une fois avec du PBS.
2. Ajouter préchauffé (à 37 ° C, critique) Accutase et incuber à 37 ° C pendant 5-10min en agitant périodiquement afin de s'assurer que les neurones sphères de cellules souches dissocié dans la cellule unique (NCSC attachement culture, les cellules incuber avec Accutase à 37 ° C pendant 5 minutes pour s'assurer que les cellules souches du follicule pileux détaché).
3. Lavez et centrifuger les cellules deux fois pendant 5 min à 200 xg à température ambiante dans du milieu DMEM/F12 pour enlever toute solution restante Accutase.
4. Re-suspendre les cellules du milieu de culture NCSC.
5. Pour la culture flottante, mettre les cellules dans des plaques de fixation ultra-faible. Pour la culture attachement, mettre les cellules dans des plaques de culture de tissus prétraités.

6. Les résultats représentatifs

NCSC milieu de culture est suffisante pour maintenir hNCSCs dans un état indifférencié sans avoir besoin de cellules nourricières. Kératinocytes prolifèrent et ne meurt peu à peu dans le milieu. Certaines petites cellules rondes vont proliférer et former de petits agrégats en suspension après 3 à 5 jours. Ces agrégats flottants lentement i augmentétaille n, générés en trois dimensions des structures de type sphère, que nous avons appelé les sphères cheveux (figure 3A). Si cultivées dans des plaques de revêtement, le SNCLC se fixer à la surface et ne forme pas de sphères. Le SNCLC jointes croître plus vite que dans la suspension. Les cellules souches sphère de formation ou attachés expriment des marqueurs SNCLC. Lorsque les follicules pileux entiers sont des cultures, les sphères sont formées au niveau de la zone correspondant à la région en boucle (figure 3B).

Figure 1. Plumés follicules anagènes (A) et télogène cheveux (B).

Figure 2. Des images représentatives de l'analyse par FACS de SNCLC panneau de gauche: les cellules sont déclenchés. Utilisant des anticorps anti-CD271 et anti-Alphe 4 anticorps d'intégrine. Panneau de droite: les cellules sont déclenchés en utilisant des anticorps anti-CD271 et anti-HNK1.

Figure 3. Morphologie des sphères cheveux (A) Morphologie des sphères flottantes cheveux, panneau de gauche:. Faible puissance, panneau de droite:. Haute puissance (B) Morphologie de la sphère cheveux in situ dans la région renflement, panneau de gauche: une sphère cheveux au télogène renflement, panneau de droite: une sphère de cheveux à la région renflement d'un follicule pileux anagène.

Discussion

Les méthodes d'isolement et de culture de cellules décrites sont reproductibles et robuste. Nous avons généré SNCLC parmi des dizaines de personnes à travers une large tranche d'âge. Bien qu'il soit préférable de traiter le tissu juste après la récolte des tissus, nous avons constaté que les tissus du cuir chevelu peuvent être stockés en toute sécurité dans les médias sur la glace pour le transport du jour au lendemain avec un impact minimal sur la viabilité cellulaire.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965-092
DMEM/F12	Invitrogen	11330-32
Heat-inactivated FBS	Hyclone	SH30071.03
B27 supplement	Invitrogen	17504044
N2 supplement	Invitrogen	17502048
bFGF	Invitrogen	PHG0026
EGF	R&D system	236-EG-01M
IGF-I	R&D system	291-G1-050
0.05% Trypsin/EDTA	Invitrogen	25300-054
Dispase	Invitrogen	17105041
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15070063
Table 1.