Isolamento e Cultura de células da crista neural-tronco de folículos capilares humanos

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo robusto para isolamento e cultura de células da crista neural-tronco de folículos capilares humanos.

Resumo

Folículos pilosos sofrem crescimento ao longo da vida e do ciclo do cabelo é um processo bem controlado envolvendo a proliferação de células-tronco e tranquilidade. Bojo de cabelo é um nicho bem caracterizada por células-tronco adultas ^1. Este segmento da bainha externa da raiz contém um número de diferentes tipos de células estaminais, incluindo as células estaminais epiteliais, células ^{2 3} tronco dos melanócitos e da crista neural, como as células-tronco ^4-7. Folículos pilosos representam uma fonte acessível e rico para diferentes tipos de células-tronco humanas. Nós e outros isolaram células-tronco da crista neural (NCSCs) de folículos capilares humanos fetais e adultos ^4,5. Estas células estaminais humanas são etiquetas de retenção de células e são capazes de auto-renovação por divisão celular assimétrica in vitro. Expressam imaturos marcadores de células da crista neural mas não os marcadores de diferenciação. Nosso estudo mostrou perfil de expressão que eles compartilham um padrão de expressão de genes com semelhante murino pele imatura neural CREcélulas st. Eles exibem multipotência clonal que podem dar origem a linhagens de células miogênicas, melanocítica, e depois neuronal in vitro de cultura de células clonal única. As células diferenciadas não só adquirir linhagem marcadores específicos, mas também demonstram funções apropriadas em condições ex vivo. Além disso, estas mostram NCSCs potencial de diferenciação para linhagens mesenquimais. Diferenciadas de células neuronais pode persistir no cérebro do rato e reter marcadores de diferenciação neuronal. Tem sido demonstrado que folículo piloso derivado NCSCs pode ajudar recrescimento dos nervos, e que melhoram a função motora em murganhos transplantados com células estaminais após estas lesões da medula espinhal atravessa em ^8. Além disso, os nervos periféricos foram reparadas com enxertos de células-tronco ^9, e implantação de células precursoras derivadas da pele adjacentes aos nervos ciáticos esmagados resultou na remielinização ^10. Portanto, o folículo piloso / pele NCSCs derivados já mostraram resultados promissores para rterapia egenerative em modelos pré-clínicos.

Somática reprogramação celular para-tronco pluripotentes induzidas (iPS) células mostrou um enorme potencial para a medicina regenerativa. No entanto, ainda há questões com muitas células iPS, em particular o efeito de longo prazo do oncogene / vírus integração e tumorigenicidade potencial das células-tronco pluripotentes não foram adequadamente tratadas. Ainda há muitos obstáculos a serem superados antes que as células iPS podem ser utilizados para a medicina regenerativa. Considerando que as células estaminais adultas são conhecidos por serem seguros e de terem sido utilizados clinicamente durante muitos anos, como o transplante de medula óssea. Muitos pacientes já se beneficiaram com o tratamento. Autólogo de células-tronco adultas são ainda preferenciais células para transplante. Portanto, as células adultas de fácil acesso e expansível-tronco em humanos de pele / cabelo folículos são uma fonte valiosa para a medicina regenerativa.

Protocolo

1. Preparação de placas de cultura de tecidos

1. Revestimento bem cada uma com suficiente poli-D-lisina (PDL) para cobrir o fundo do poço. Permitir que as placas a secar ao capuz.
2. Depois de as cavidades são secos, enxaguar com água estéril, e aspirar. Permitir que as placas a secar ao capuz.
3. Quando pêlo, seca com fibronectina (que foi dissolvido em água BioWhittaker noite a 37 ° C a uma concentração de 1 mg em 6 ml).
4. Adicionar meio NCSC [DMEM/F12 95 ml, 1 ml Penn / Strep (P / S), 1 ml de N2, 2 ml B27, 100 ul de mercaptoetanol (2ME, 50 mM de estoque), bFGF (20 médio ng / ml), IGF -1 (20 ng / ml de meio) e EGF (20 ng / ml de meio)], antes de fibronectina seca nas placas,

2. Extrair células do folículo piloso de couro cabeludo humano

1. Antes de iniciar o procedimento de isolamento NCSCs, uma necessidade de preparar os respectivos meios e reagentes (ver Tabela 1).
2. Pele do couro cabeludo fresco humano adulto de procedimentos facelift ou fetecido do couro cabeludo tal é recolhida, lavada com PBS contendo penicilina-estreptomicina.
3. A pele é então transferido para tubos de 50 ml e incubadas em DMEM com Dispase (10 mg / ml) durante a noite a 4 ° C. Incubação durante 2-4 horas a 37 ° C é também eficaz. Pedaços de pele deve ser uma largura máxima de 1 cm para permitir a penetração da enzima.
4. Transferir a pele para uma placa de Petri esterilizada, retirar cada fio a partir da pele, agarrando a haste do cabelo próximo da superfície da pele e puxando firmemente e suavemente. Os folículos do cabelo ou da morfologia mostram anágena (Figura 1A) ou telógena (Figura 1B).
5. Incubar os fragmentos isolados de folículos em 0,05% de tripsina-EDTA (Invitrogen) por 15-20 min à temperatura ambiente com agitação periódica, adicionar 4 ml de DMEM com FBS a 10% para parar a reacção. O epitélio folicular é tripsinizadas e filtrada através de filtro de 40 um para obter uma suspensão de célula única que contém as células de diferentes tamanhos e formas.
6. Girara 200 xg durante 5 min, descartar o sobrenadante cuidadosamente, re-suspender em 1 mL de PBS contendo soro a 2% (FBS).
7. Alternativamente, folículos pilosos depenados podem ser colocados em cultura sem digestão com tripsina a crescer esferas de cabelo in situ.

3. Isolamento de NCSCs folículo piloso Usando Fluxo de separação de células citométrico

1. Folículo piloso suspensão de células individuais foram obtidos por digestão com tripsina e marcados com anticorpos contra CD271 (APC-conjugado) / HNK1 (conjugado com FITC) ou CD271 / integrina alfa 4 (PE-conjugado) durante 40 min em gelo, no escuro.
2. Centrifugar durante 5 minutos a 200 xg, à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante.
3. Ressuspender as células em PBS contendo soro a 2% (FBS), e antes da separação, a PI é adicionado a porta para fora as células mortas.
4. Executar separação de células por citometria de fluxo (FACS). Colete CD271 +, + HNK1 duplas células positivas ou CD271 +, + integrina alfa 4 duplas células positivas (Figura 2).
5. Depois de tipoing, CD271 +, + HNK1 duplas células positivas ou CD271 +, + integrina alfa 4 duplas células positivas são cultivadas em placas ultra-baixas de fixação no suporte NCSC

4. Cultura de NCSCs primários

1. Cultura das células foliculares dissociados ou FACS ordenadas células em placas de ultra-baixas de fixação no meio NCSC, mudar de médio a cada dia.
2. Verifique cultura de células a cada dia sob o microscópio. NCSCs começará a formar pequenos agregados flutuantes após vários dias e bem formadas esferas em 2-5 semanas em cultura, dependendo da idade dos dadores (Figura 3A). Conseqüência aparecerá em poucos dias na região bojo e bem formados esferas in situ em várias semanas (Figura 3B) quando folículos inteiros são cultivadas no meio NCSC.

5. Expansão da NCSCs

1. Lave as células uma vez com PBS.
2. Adicionar pré-aquecido (a 37 ° C, crítico) Accutase e incubar a 37 ° C durante 5-10min com agitação periodicamente para certificar-se de esferas de células-tronco neurais dissociada em única célula (para NCSC penhora de cultura, as células incubadora Accutase a 37 ° C por 5 minutos para ter certeza que as células-tronco do folículo de cabelo separado).
3. Lave as células duas vezes e centrifugar durante 5 minutos a 200 xg, à temperatura ambiente, em meio DMEM/F12 para remover qualquer solução restante Accutase.
4. Re-suspender as células com meio de cultura NCSC.
5. Para a cultura flutuante, colocar as células em placas de ultra-baixos de fixação. Para a cultura anexo, colocar as células em placas de cultura de tecidos pré-tratados.

6. Resultados representativos

NCSC meio de cultura é suficiente para manter hNCSCs num estado indiferenciado, sem a necessidade de células de alimentação. Os queratinócitos não irão proliferar e gradualmente morreu no meio. Certas pequenas células redondas irão proliferar e formar pequenos agregados em suspensão após 3 a 5 dias. Estes agregados flutuantes aumentada lentamente in dimensões, gerados tridimensionais esfera estruturas semelhantes, que nós denominamos esferas de cabelo (Figura 3A). Se em cultura em placas revestidas, as NCSCs vai anexar à superfície e não formam quaisquer esferas. Os NCSCs anexados crescer mais rápido do que em suspensão. As células-tronco formadoras de esfera ou anexado expressam marcadores NCSCs. Quando folículos pilosos inteiras são as culturas, as esferas são formadas na área correspondente à região de protuberância (Figura 3B).

Figura 1. Arrancado anágena (A) e telógena folículos (B) de cabelo.

Figura 2. Imagens representativas de análise FACS de NCSCs painel esquerdo:. Células são gated usando anti-CD271 e anti-alphe quatro anticorpos integrina. Painel da direita: as células são gated utilizando anticorpos anti-CD271 e anti-HNK1.

Figura 3. Morfologia das esferas de cabelo (A) Morfologia das esferas de cabelo flutuante, painel esquerdo:. Baixa potência, direito do painel:. Alta potência (B) Morfologia da esfera cabelo in situ na região da barriga, painel esquerdo: uma esfera de cabelo em bojo telógeno, painel direito: uma esfera de cabelo na região bojo de um folículo piloso anágena.

Discussão

Os métodos de isolamento e de cultura de células descritas são reprodutíveis e robusto. Geramos NCSCs de dezenas de indivíduos através de uma ampla faixa etária. Embora seja melhor para processar o tecido logo após a colheita de tecidos, descobrimos que os tecidos do couro cabeludo pode ser armazenado com segurança em meios de comunicação sobre o gelo para o transporte durante a noite com um impacto mínimo sobre a viabilidade celular.

É importante para o tratamento do tecido do ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965-092
DMEM/F12	Invitrogen	11330-32
Heat-inactivated FBS	Hyclone	SH30071.03
B27 supplement	Invitrogen	17504044
N2 supplement	Invitrogen	17502048
bFGF	Invitrogen	PHG0026
EGF	R&D system	236-EG-01M
IGF-I	R&D system	291-G1-050
0.05% Trypsin/EDTA	Invitrogen	25300-054
Dispase	Invitrogen	17105041
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15070063
Table 1.