监测RNA结构平衡的变动情况“过氧化”和“氧化”羟基自由基足

摘要

本协议描述了如何量化的镁（二）依赖RNA的三级结构的形成由两个羟基自由基足迹方法。

摘要

RNA分子在生物学中发挥的重要作用。除了传递遗传信息，RNA折叠成独特的三级结构，实现特定的生物学作用，作为调节剂，粘结剂或催化剂。有关大专院校的联系形成的信息是必须了解的RNA分子的功能。羟基自由基（•OH）是独特的结构由于其反应活性高，体积小的核酸探针。，作为一个足迹探头使用时，羟基自由基地图的溶剂可及表面的DNA和RNA的磷酸骨干如单核苷酸分辨率罚款。羟基自由基足可以用来识别内分子间的接触面，例如在DNA -蛋白质和RNA -蛋白质复合物的核苷酸。 ³平衡和动力学⁴转换可以由羟基自由基足迹作为一个soluti功能进行变量或时间，分别。的足迹的一个主要特点是有限的接触探头（例如，“单次击中动力学”）中的每个核苷酸的聚合物均匀采样^的结果。5

在这个视频文章中，我们使用的四膜虫核酶的小四至小六的域名，说明RNA样品制备和一个镁（II）介导的折叠等温线的决心。我们描述了使用众所周知的羟基自由基足迹协议，要求H _{2 O} 2（我们称之为“过氧化”协议）和一个有价值的，但并不广为人知，替代使用自然溶解O ₂的（我们称之为“氧化“协议）。提交的数据压缩，转换和分析程序概述。

研究方案

1。足迹试剂的制备

1. 准备了10倍的反应缓冲液含有钠cacodylate 100毫米，1毫米EDTA和1个M氯化钾。调整pH值至7.4。使用0.2μm的醋酸纤维过滤设备（NALGENE）过滤器的缓冲区。注：不吸管的RNA直接到10倍缓冲区。
2. 准备如表1所示，每个反应的滴定反应混合。滴定混合量（1X缓冲和镁（二）所需的浓度）应为90μL，然后加入1X缓冲的RNA加入10μl。
3. 准备一个核糖核酸酶T1消化缓冲液6.63M尿素，柠檬酸钠20MM，为1mM EDTA，0.25微克/μL的tRNA，0.025％二甲苯蓝，0.025％溴酚蓝。这个缓冲区可以存储在4℃至6个月。
4. Fenton反应需要250毫米的铁（NH _{4）2（SO 4）2，250}毫米EDTA，和500毫米L -抗坏血酸钠新鲜配制的水溶液。浓度在第1章指出.5是平衡的实验，如钠cacodylate缓冲区，不清除自由基和不同的二价离子浓度的最佳选择。
5. 过氧化（1.5.1）和氧化（1.5.2）的足迹反应试剂。
   1. 过氧化Fenton反应需要100毫米的铁EDTA的解决方案，和50毫米钠L -抗坏血酸和1.5％H _{2 O 2，}新鲜配制的水溶液。准备用EDTA铁EDTA溶液混合铁（NH _{4）2（SO 4）2，}有超逾铁EDTA的1.1倍。
   2. 前发起的氧化裂解反应（3.4.2），创建相结合，2μL的Fe（NH _{4）2（SO 4）2（250}毫米），EDTA的2.2μL（250毫米），62.5μLFenton反应组合L -抗坏血酸钠（500毫米），22.5μL10X反应缓冲液和135.5μLH _{2 O的}终浓度达到0（3.4.2）的足迹反应混合物。，分别为10毫米，0.11毫米和6.61毫米。

2。足迹实验RNA的制备

1. RNA可以在体外转录DNA模板⁶标准生产，如果少于50个核苷酸，购买（例如，在集成DNA技术，www.idtdna.com ）。实验室按照建议的清洁程序，以保持在足迹实验样品RNA的完整性。
2. ⁸脱磷，在体外转录RNA是必要的^前 32 P标签的RNA的5'端。 10 pmol kinasing末端标记的RNA ⁹解决方案应该是成功的磷酸灭活后的阴天。
3. 净化放射性标记的RNA变性凝胶电泳。随后的两个凝胶0.3 M醋酸钠（pH 5.5）中提取的RNA恢复。 RNA沉淀混合水溶液0.5毫升，1毫升乙醇和随后孵育1分钟干冰。在4 ° C，12500 RPM 0.5小时旋转样品。弃上清，用70％乙醇洗涤RNA沉淀。额外的离心去除上清液后，在真空干燥颗粒。
4. P标记^的 32 RNA样品溶解在330 UL 1X Buffer.Pipet 30μL的反应管中的RNA溶液，沉淀用乙醇和真空干燥RNA生成参考阶梯（步骤3.5），保持此管。变性加热的缓冲的RNA溶液在95 ° C为2分钟。样品冷却到室温为15分钟，快速旋转，使管放回解决方案的盖子上的冷凝液。

3。足迹实验

1. 电泳梳，确定每分析凝胶的数据点的最大数量。我们使用30梳。参考阶梯占地2井和uncleaved控制之一。准备27个反应管。最后MG（二）concentrati项应均匀分布的对数遍及各地的滴定中点量级的规模。
2. 另外，在50 RNA和镁（二）解决方案° C孵育5分钟。 90（二）镁相应数额在1x缓冲液10μLRNA溶液混合，达到100微升的最终体积。孵育30分钟的解决方案，在50 ° C。
3. 让我们的解决方案，在25 ° C为1小时的平衡而发生折叠。
4. 过氧化（3.4.1）（3.4.2）或氧化羟基自由基足迹反应。
   1. 开始放置铁EDTA（100毫米）2μL液滴的过氧化反应，反应的顶部内彼此分开2μLL -抗坏血酸钠（50毫米）和2μlH _{2 O} 2（1.5％ ）管内含有RNA的解决方案，并开始严厉混合的足迹反应。停止15秒后加入300μL冷无水乙醇的反应。转动管的3-5倍。沉淀，洗涤和在步骤2.4干燥沉淀。
   2. 加入5μL新鲜配制的Fenton反应混合物（1.6）开始氧化羟自由基footprintingreaction。孵育30分钟，在25 ° C。添加300μL冷无水乙醇淬火反应和组合转向管的3-5倍。沉淀，清洗和干燥的颗粒为在步骤2.4中表示。
5. 根据标准程序¹⁰使用在步骤1.3编写的解决方案生成一个核糖核酸酶T1消化参考样本。
6. 溶解于8μL凝胶上样染料II（Ambion公司），并确认RNA的RNA颗粒悬浮使用盖革计数器。
7. ^11。负载样本，包括两个引用和控制的标准协议，准备变性，8％聚丙烯酰胺测序胶。独立的RNA片段在60瓦 - 75 W为2.5小时。干凝胶置于存储荧光粉屏幕一夜之间。扫描成像系统胶片放射自显影，如荧光屏。风暴865（GE Healthcare公司）或台风（GE Healthcare公司）。凝胶图像文件传输到您的计算机。

4。数据分析

1. 每个核苷酸的羟基自由基反应，是由每个频带的量化分析凝胶强度。下载，安装和开放SAFA，一个易于使用的开源软件为单波段的装修和^{量化12，13}按照用户手册的说明。简而言之，负载的RNA序列。txt文件的后面。凝胶文件的凝胶图片。调整波段的强度，定义车道，选择一个锚车道，并执行凝胶对齐。频段分配到核苷酸发生在核糖核酸酶T1消化阶梯参考。乐队量化积分和使用的正常化/ colorplot功能正常化和分配潜在不变的残留物。另存为。txt文件的输出。
2. SAFA输出电子表格，其中包含代表胶道和行代表在列tegrated波段相应的RNA片段的单个波段的密度。首先，确定保护的网站显示在溶剂可显着的变化，通过比较没有镁（II）与终点毫克（二）浓度在我们的例子（50毫米）的配置文件样本所得的个人资料的保护。该值越低，受保护的碱基对羟基自由基的攻击，反之亦然。
3. 创建折叠等温线从个人或群组的核苷酸与镁（Ⅱ）浓度的归波段积分。等温线是单独缩放FI = L +（U - L）的分数饱和度• 其中，f表示乐队的集成密度（S）分析，L和U代表的上限和下限过渡 ¹⁴的数据都适合使用非线性升是小数饱和。东广场分析程序（我们使用或者原产地（OriginLab）或GraphPad（GraphPad软件公司）。）向山式（1）
   
   其中_K，D是平衡解离常数，[M]，对应的变量，可调节的折叠反应，镁（二）在这个例子中_的浓度，N H Hill系数。此过程尺度过渡到小数饱和，决定了它的中点，并提供了一​​个过渡是否是S形的现象学测试。来自测序凝胶（图3A）SAFA（图3B）进行了分析和适合如上所述的等温线如图3C所示。如图3所示的分数饱和等温线所产生的电子表格中的缩放SAFA产生对最适合使用的方程分数的上限和下限（U和 L）值=值 /（U - L） - L /（ U - L）。

5。代表性的成果：

图3显示了代表小四至小六的RNA•OH足迹实验的结果。凝胶图像（左）表示，一）背景乳沟是最小的（右线），B）单核苷酸分配是可能的，因为在T1巷（核糖核酸酶T1劈开每个G）定义的乐队，和c）的羟基自由基诱导的RNA碎片以及上述背景。从低到高镁（二）的过渡是隶属于下降表明RNA三级结构形成的乐队的个人和组的集成条带密度。单次或连续核苷酸的裂解变化随之而来被称为一个“保护”的群体。 •OH保护镁（二）特点的小四至小六RNA介导的折叠密切对应溶剂人迹罕至的地区，其晶体结构中观察到的分子。

折叠的RNA分子的彗星一个有非常明显的结构性或动态的现象，但没有与相关的大专接触保护的不同程度（即，如何接近背景带密度下降）。因此，一些RNA分子将显示定义良好的结构转换，如在图3所示，而有些则不会。乐队强度SAFA ¹²分析（图3B）量化和规范化。输出是一个“热”的，可视情节对•OH的相对程度的保护。颜色过渡介绍后，镁（二）除无障碍变化。白色红色或蓝色显示更容易或多个受保护的核苷酸，分别。每个阴影的程度，是隶属于一个数值，可以被绘制成一个保护曲线（图3C），如山式（1）通过一项具有约束力的模型分析。解离常数与保护153-155附属的平衡是两倍左右，相应的价值，保护163-164。

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图1。羟自由基的生产和P4 - P6 RNA折叠。 A）铁（II）催化羟自由基的过氧化氢的生成。抗坏血酸亚铁降低铁（Ⅲ）回。 B）在镁（二）的情况下，没有小四至小六的三级结构形成，使羟基自由基渗透和切割所有可访问的骨干岗位。增加镁（二）启动折叠小四至小六，只允许溶剂可及骨干羟基自由基裂解。

图2。大纲为羟基自由基足迹实验。一）Dephophorylation和^32个P 5' -端的RNA标记。二）净化³² P标记在变性聚丙烯酰胺凝胶中的RNA。三）RNA的频段切除，随后的RNA提取，乙醇沉淀。 ð）Prefolding和折叠的RNA。五）新鲜准备的Fenton反应混合物除了生成羟基自由基。 F）的RNA片段，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。 G）的定量RNA片段SAFA软件。

图3过氧化芬顿足迹反应后的RNA片段分析。 （一）的RNA被暴露的羟基自由基和卵裂产品使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）得到解决。图片显示，增加镁的浓度（二）过氧化裂解产物。参考和控制车道标记。此图像文件的SAFA的方案，其中定量每个频段的音量输入。 （二）“热”的情节所产生的SAFA。 （三）有关集成条带密度SAFA核苷酸的数量输出值的电子表格是如山equati绑定模型分析（1）。保护区被选为乐队Mg（II）浓度的功能不可或缺的密度增加。在K _D是在被监控的网站，其中一半的RNA折叠的Mg（II）的浓度。 Hill系数_，N H，是衡量斜坡曲线上具有约束力的协同信息，并提供了一个在这个特定的站点折叠的镁离子的数量的较低的估计。

表1卷生成的RNA样品含有不同的Mg（II）浓度的代表。

讨论

羟基自由基足迹是一个有价值的工具，以评估核酸的溶剂可及表面面积。定性和定量的形成三级结构^14，可以遵循作为一个功能参数，如离子种类和浓度，pH值，温度，结合蛋白或折叠的共同因素。引人注目的一条直线前进和廉价的协议，以及由此产生的溶剂可及单核苷酸水平上的折叠信息的结合，使得这种方法非常有吸引力的。传统的•OH足迹反应是增加H _{2 O 2，}我们称为“过氧?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Cat#
Sodium Cacodylate(Caution! Toxic)	Sigma-Aldrich	C4945-25g
EDTA (0.5 M)	Ambion	AM9260G
DEPC treated water	Ambion	AM9915G
Sodium Acetate (3 M)	Ambion	AM9740
MgCl2 (1 M)	Ambion	AM9530G
Urea	Ambion	AM9902
Sodium Citrate	Sigma-Aldrich	W302600
tRNA	Sigma-Aldrich	R-7876
Sodium-L-ascorbate	Sigma-Aldrich	A7631-25g
Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O	Sigma-Aldrich	F1543-500g
RNase T1	Fermentas	EN0541
Hydrogen Peroxide (30%)	Sigma-Aldrich	349887