שיווי משקל ניטור שינויים ב-RNA על ידי מבנה 'Peroxidative' ו 'חמצוני "footprinting רדיקלי הידרוקסיל

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד לכמת את Mg (II) תלויי היווצרות של RNA מבנה שלישוני על ידי שתי שיטות footprinting רדיקלי הידרוקסיל.

Abstract

מולקולות רנ"א תפקיד חיוני בביולוגיה. בנוסף להעברת המידע הגנטי, RNA יכול להתקפל למבנה שלישוני ייחודי למלא תפקיד ביולוגיים ספציפיים כמו קלסר הרגולטור, או זרז. מידע על היווצרות קשר שלישוני הכרחי להבין את הפונקציה של מולקולות RNA. רדיקלים הידרוקסיל (OH •) הן בדיקות ייחודי של המבנה של חומצות גרעין בשל תגובתיות גבוהה שלהם בגודל קטן. ¹ כאשר שימש בדיקה footprinting, רדיקלים הידרוקסיל למפות את פני השטח נגיש ממס של עמוד השדרה phosphodiester של ה-DNA ו-RNA ¹ עם ² קנס כמו רזולוציה נוקלאוטיד בודד. Footprinting רדיקלי הידרוקסיל יכול לשמש כדי לזהות את נוקלאוטידים בתוך משטח מגע מולקולאריים, למשל חלבון-DNA ^ו-RNA-1 חלבון קומפלקסים. שיווי משקל ³ ו ⁴ מעברים הקינטית ניתן לקבוע על ידי ביצוע footprinting רדיקלי הידרוקסיל כפונקציה של solutiעל משתנים או זמן, בהתאמה. תכונה מרכזית של footprinting היא כי חשיפה מוגבלת בדיקה (למשל, "יחיד פגע קינטיקה ') תוצאות דגימה אחידה של כל נוקלאוטיד של הפולימר. ⁵

במאמר זה וידאו, אנו משתמשים תחום P4-P6 של ribozyme Tetrahymena כדי להמחיש הכנה RNA מדגם וקביעת (II) בתיווך איזותרמות Mg מתקפלים. אנו מתארים את השימוש בפרוטוקול footprinting הידרוקסיל ידוע קיצוני הדורש H ₂ O ₂ (שאנו מכנים זה את פרוטוקול "peroxidative") לבין בעל ערך, אך לא ידוע, חלופה המשתמשת O טבעי מומס ₂ (אנחנו קוראים לזה ' חמצוני "פרוטוקול). סקירה כללית של צמצום הנתונים, שינוי נהלים ניתוח מוצג.

Protocol

1. הכנה של ריאגנטים footprinting

1. הכן חיץ התגובה 10x המכיל נתרן 100 mM cacodylate, 1 mM EDTA, ו 1 M KCl. התאם את ה-pH ל -7.4. סנן החיץ באמצעות אצטט 0.2 מיקרומטר מסנן למכשיר (Nalgene). הערה: לא RNA pipet ישירות לתוך חוצץ 10x.
2. מכינים את תערובת התגובה טיטרציה עבור כל תגובה כמפורט בטבלה 1. נפח לערבב טיטרציה (1x חיץ Mg (II) בריכוז הרצוי) צריך להיות 90 μl, לפני הוספת 10μl של רנ"א במאגר 1x.
3. הכן חיץ T1 RNAse העיכול המכיל אוריאה 6.63M, ציטרט הנתרן 20mm, 1mm EDTA, 0.25 מיקרוגרם / μl tRNA, cyanol קסילן 0.025%, וכחול bromphenol 0.025%. חיץ זה ניתן לאחסן 4 ° C עד 6 חודשים.
4. תגובת פנטון דורשת תמיסות מימיות המוכן טרי של 250 מ"מ Fe (NH _{4) 2} (SO _{4) 2,} 250 mM EDTA, נתרן 500 mM ו-L-ascorbate. ריכוזים ציינו בפרק 1.5 הם אופטימליים עבור ניסויים שיווי משקל חיץ כגון cacodylate נתרן שאינו לחפש רדיקלים ומגוונים ריכוזי יון divalent.
5. ריאגנטים עבור התגובה (1.5.2) peroxidative (1.5.1) ו footprinting חמצוני.
   1. התגובה peroxidative פנטון דורשת תמיסות מימיות של פתרון מוכן טרי 100 Fe-EDTA מ"מ, ו 50 נתרן mM L-ascorbate ו -1.5% H ₂ O _2. הפתרון Fe-EDTA הוא מוכן על ידי ערבוב Fe (NH _{4) 2} (SO _{4) 2} עם EDTA יש פי 1.1 עודף של EDTA על ברזל.
   2. רגע לפני שיזם את התגובה מחשוף חמצוני (3.4.2), ליצור את התמהיל התגובה פנטון על ידי שילוב של 2 μl Fe (NH _{4) 2} (SO _{4) 2} (250 מ"מ), 2.2 μl של EDTA (250 מ"מ), 62.5 μl נתרן L-ascorbate (500 מ"מ), 22.5 תגובה μl חיץ 10x ו 135.5 μl של H ₂ O להגיע אל ריכוזי הסופי בתערובת footprinting תגובה (3.4.2) של 0.10 מ"מ, 0.11 מ"מ, 6.61 מ"מ, בהתאמה.

2. RNA הכנה לקראת ניסוי footprinting

1. RNA יכול להיות מיוצר על ידי תקן שעתוק במבחנה של תבניות DNA ⁶ או, אם פחות מ 50 נוקלאוטידים, ניתן לרכוש (למשל ב-DNA משולב טכנולוגיות, www.idtdna.com). עקבו מומלץ ניקיון נהלים מעבדה כדי לשמור על שלמות מדגם של רנ"א במהלך הניסויים footprinting ^7.
2. Dephosphorylation ⁸ של במבחנה RNA עיבד הכרחי לפני תיוג ³² P הסוף "5 של רנ"א. 10 pmol של רנ"א הם סוף שכותרתו ידי kinasing. ⁹ הפתרון צריך להיות מעונן לאחר איון מוצלח של phosphatase.
3. לטהר RNA מסומן רדיואקטיבית בעזרת ג'ל אלקטרופורזה denaturing. רנ"א הוא התאושש לאחר מכן על ידי שתי עקירות באמצעות ג'ל 0.3 נתרן אצטט M (pH 5.5). RNA הוא זירז ידי ערבוב 0.5 פתרון מ"ל מימית עם אתנול 1 מ"ל ובעקבותהדגירה דקה 1 על קרח יבש. ספין מדגם ב 4 ° C, 12,500 סל"ד עבור 0.5 שעות. בטל supernatant ולשטוף RNA גלולה עם אתנול 70%. הסר supernatant לאחר צנטריפוגה נוספים יבש גלולה בחלל ריק.
4. ממיסים את ^P-32 שכותרתו דגימות רנ"א ul 330 μl של 1x Buffer.Pipet 30 הפתרון RNA בצינור תגובה, המשקע עם אתנול ו-RNA יבש בחלל ריק; לשמור על צינור להפקת הסולם הפניה (שלב 3.5). לפגל הפתרון שנאגרו RNA על ידי חימום על 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. מגניב דגימות לטמפרטורת החדר במשך 15 דקות ולתת סיבוב מהיר כדי להפיל את ותרכיזים על העפעפיים של צינורות אל הפתרון.

3. ניסוי footprinting

1. מסרק אלקטרופורזה קובע את המספר המרבי של נקודות נתונים לכל ג'ל אנליטית. אנו משתמשים גם מסרק 30. סולם התייחסות תופסת 2 בארות אחד לשלוט uncleaved. הכן 27 מבחנות התגובה. Mg הסופי (II) concentratiתוספות צריכה להיות מחולקת באופן שווה על סולם לוגריתמי פורש סדרי גודל סביב אמצע טיטרציה.
2. בנפרד, דגירה את הרנ"א (II) פתרונות Mg ב 50 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מערבבים 10 μl של פתרון RNA עם μl 90 סכום המקביל Mg (II) במאגר 1x להגיע נפח סופי של 100 μl. דגירה הפתרונות למשך 30 דקות ב 50 ° C.
3. בואו הפתרונות לאזן במהירות של 25 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 תוך קיפול מתרחשת.
4. Peroxidative (3.4.1) או חמצוני (3.4.2) footprinting הידרוקסיל תגובה קיצונית.
   1. התחל את התגובה peroxidative ידי הצבת טיפות של μl 2 Fe-EDTA (100 מ"מ), 2 נתרן μl L-ascorbate (50 מ"מ) 2 μl H ₂ O ₂ (1.5%) מופרדים זה מזה על החלק הפנימי העליון של התגובה שפופרת המכילה את הפתרון RNA ולהתחיל את התגובה footprinting ידי ערבוב נמרץ. עצור את התגובה לאחר 15 שניות על ידי הוספת 300 μl אתנול אבסולוטי קר. סובבו את הצינורות 3-5 פעמים. , לזרז לרחוץיבש את הכדור כמו בשלב 2.4.
   2. הפעל את footprintingreaction חמצוני רדיקלי הידרוקסיל ידי הוספת 5 μl של תמהיל פנטון מוכן טרי התגובה (1.6). דגירה למשך 30 דקות במהירות של 25 ° C. הוסף 300 μl של אתנול אבסולוטי קר להרוות את התגובה ומערבבים על ידי סיבוב צינורות 3-5 פעמים. נמהרת, לשטוף ולייבש גלולה כמצוין בשלב 2.4.
5. צור T1 RNase מדגם לעכל התייחסות פי הנהלים תקן ¹⁰ באמצעות פתרון מוכן בשלב 1.3.
6. ממיסים כדורי רנ"א 8 μl ג'ל טעינת צבע II (AMBION) ולאשר RNA הוא resuspended באמצעות מונה גייגר.
7. הכן denaturing, 8% רצף ג'ל polyacrylamide על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. ¹¹ דגימות טען כולל שתי הפניות שליטה. הפרד RNA שברים ב 60 וואט - 75 וואט עבור 2.5 שעות. לחשוף ג'ל יבשים למסך אחסון זרחן לילה. סריקה זרחן מסך עם מערכת הדמיה עבור autoradiography filmless, למשל. סטורם 865 (GE Healthcare), או טייפון (GE Healthcare). העברת קובץ התמונה ג'ל למחשב.

4. ניתוח נתונים

1. תגובתיות רדיקלי הידרוקסיל של כל נוקלאוטיד נקבעת על ידי כימות עוצמת הלהקה על כל ג'ל האנליטי. הורד, התקן ולפתוח ספא, קל לשימוש בתוכנות קוד פתוח עבור הולם הלהקה כימות יחיד. ^{12, 13} בצע את ההוראות במדריך למשתמש. בקצרה, לטעון את רצף הרנ"א כמו. קובץ txt ואחריו התמונה ג'ל כקובץ. ג'ל. התאם בעוצמות הלהקה, להגדיר את הנתיבים, לבחור במסלול עוגן, ולבצע יישור ג'ל. הקצאה של להקות כדי נוקליאוטידים מתרחשת התייחסות סולם העיכול T1 RNase. לכמת את אינטגרלים הלהקה להשתמש בתכונת נורמליזציה / colorplot לנרמל ולהקצות שאריות משתנה פוטנציאלי. שמור את הפלט כקובץ txt..
2. ספא פלטי גיליון אלקטרוני המכיל עמודות המייצגות נתיבים על הג'ל שורות המייצג את בtegrated צפיפות הלהקה של להקות בודדות המקביל לקטע RNA. ראשית, לזהות את האתרים שבהם הגנה להציג שינוי ניכר בנגישות ממס על ידי השוואת פרופיל הגנה נגזר מדגם לא Mg (II) עם פרופיל של ריכוז נקודת הסיום (II) Mg (50 מ"מ בדוגמא שלנו). הנמך את הערך, המוגן יותר נוקלאוטיד הוא נגד ההתקפה מפני רדיקלים הידרוקסיל ולהיפך.
3. צור איזותרמות מתקפל מן אינטגרלים הלהקה מנורמל של יחידים או קבוצות של נוקליאוטידים לעומת ריכוז (II) Mg. איזותרמות הם מדורגים בנפרד הרוויה השבר על ידי fi = L + (U - L) • היכן f מציין את צפיפות משולב של הלהקה (ים) להיות מנותח, L ו-U מייצגים את גבולות העליון והתחתון המעבר ו היא רוויה חלקיים. ¹⁴ הנתונים הם בכושר באמצעות l שאינו ליניאריממזרח לכיכר תוכנית ניתוח (אנו משתמשים גם מקור (OriginLab) או GraphPad (GraphPad תוכנה, Inc).) למשוואה היל (1),
   
   היכן K _d הוא קבוע הדיסוציאציה בשיווי משקל, [ז] מתאים לריכוז של המשתנה כי מתווכת התגובה מתקפלים, Mg (II) בדוגמה זו, _H n הוא מקדם היל. זה קשקשים הליך המעבר הרוויה השבר, קובע נקודת האמצע שלה מספק מבחן הפנומנולוגית של אם המעבר הוא sigmoidal. איזותרמות נגזר רצף ג'לים (איור 3A) אשר נותחו על ידי סאפא (איור 3B) ובכושר כמתואר לעיל מוצגים באיור 3C. איזותרמות הרוויה השבר שמוצג באיור 3 נוצרו על ידי דרוג בגיליון אלקטרוני הערכים שנוצרו על ידי ספאא נגד גבולות הטוב העליון והתחתון מתאים (U ו-L) באמצעות חלק במשוואה = ערך / (U - L) - L / (U - L).

5. נציג תוצאות:

איור 3 מציג תוצאות נציג P4-P6 RNA • ניסויים OH footprinting. התמונה ג'ל (משמאל) מציין כי המחשוף) הרקע הוא מזערי (נתיב ימין), ב) הקצאה נוקלאוטיד יחיד אפשרי בגלל להקות הגדיר היטב את השביל T1 (RNase cleaves T1 בכל G), ו - ג) רדיקלי הידרוקסיל הפיצול המושרה של RNA הוא הרבה מעל הרקע. המעבר מ נמוך Mg גבוהה (II) המזוהה עם הפחתת צפיפות הלהקה משולבת של בודדים וקבוצות של להקות המעיד על היווצרות של RNA מבנה שלישוני. יחיד או קבוצות של נוקלאוטיד רציף אשר מחשוף שינויים במקביל מכונים 'הגנה'. • הגנות OH האופייניים של Mg (II) בתיווך קיפול של P4-P6 RNA מקרוב מתאימות האזורים נגיש ממס של המולקולה שנצפתה המבנה הגבישי שלה. ¹⁵

מולקולות רנ"א מקופל ג יש ובמידות שונות מאוד (כלומר, כמה קרוב רקע הירידה בצפיפות הלהקה) של הגנה קשר שלישוני שלא היה בקורלציה עם תופעה מבנית או דינמי ברור. לכן, כמה מולקולות רנ"א יראה מעברים מבנית מוגדרת היטב, כפי שמוצג באיור 3, וחלק לא. עוצמות בנד הם לכמת מנורמל על ידי ניתוח ¹² צפא (איור 3B). הפלט הוא מזימה "תרמית" לדמיין את מידת היחסי של הגנה מפני • OH. המעבר צבע מתאר את השינוי על נגישות בנוסף (II) Mg. הלבן מראה אדום או כחול נוקלאוטידים נגיש יותר או מוגנת יותר, בהתאמה. מידת כל של הצללה המזוהה עם ערך מספרי אשר ניתן להתוות כמו עקומת הגנה (איור 3 ג) ונותחו על ידי מודל מחייב כגון המשוואה היל (1). שיווי משקל קבוע דיסוציאציה המזוהים עם הגנת 153-155 הוא בערך כפול מזה של הערך המקביל להגנת 163-164.

ontent ">
באיור 1. ייצור רדיקלי הידרוקסיל ו P4-P6 קיפול RNA. א) Fe (II) מזרז לייצור של רדיקלים של הידרוקסיל מי חמצן. Ascorbate מפחית Fe (III) חזרה ברזל ברזל. ב) בהעדר Mg (II), מבנה לא P4-P6 שלישוני נוצר, המאפשר רדיקלים הידרוקסיל לחדור לפלח כל הפוזיציות עמוד השדרה נגיש. תוספת של Mg (II) יוזם קיפול של P4-P6, המאפשר רק את עמוד השדרה נגיש ממס להיות ביקע ידי רדיקלים הידרוקסיל.

באיור 2. תמציתי לניסוי footprinting הידרוקסיל רדיקל. Dephophorylation) ו - ³² P 5'-end תיוג של רנ"א. ב) טיהור של ³² P-RNA מסומן על ג'ל polyacrylamide denaturing. ג) כריתה של הלהקה RNA, לאחר מיצוי RNA, משקעים אתנול. D) ו Prefoldingקיפול של רנ"א. ה) תוספת של תערובת פנטון טרי שהוכן התגובה ליצירת רדיקלים הידרוקסיל. F) RNA ההפרדה שבר ידי denaturing ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide. G) quantitation של שברי RNA על ידי תוכנה סאפא.

באיור 3. ניתוח של שברי RNA לאחר התגובה פנטון peroxidative footprinting. (א) RNA נחשף רדיקלים הידרוקסיל והמוצרים מחשוף נפתרו באמצעות denaturing ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide (עמוד). התמונה מראה המוצרים מחשוף peroxidative עם ריכוז גדל והולך של Mg (II). נתיבי הפניה ושליטה מסומנים. זה קובץ תמונה הוא קלט לתוכנית ספא ​​אשר quantitates נפח הלהקה כל אחד. (ב) מזימה "תרמית" שנוצר על ידי סאפא. (ג) גיליון אלקטרוני של ערכים הנוגעים צפיפות הלהקה משולבת פלט מספר נוקלאוטידים מתוך ספא מנותח על ידי מודל מחייב כגון equati הילעל (1). אזורי הגנה נבחרו על פי להגדיל את צפיפות הלהקה אינטגרלי כפונקציה של ריכוז (II) Mg. _ד K הוא הריכוז (II) Mg שבו מחצית RNA הוא מקופל באתר במעקב. מקדם היל, n _H, הוא מדד של השיפוע של העקום אשר נותן מידע על cooperativity מחייב מספק הערכה נמוכה יותר עבור מספר יוני מגנזיום מעורב קיפול של האתר המסוים הזה.

טבלה 1. כרכים נציג ליצירת דגימות RNA המכיל שונים (II) ריכוזים Mg.

Discussion

Footprinting רדיקלי הידרוקסיל היא כלי רב ערך כדי להעריך את אזור ממס משטח נגיש של חומצות גרעין. היווצרות איכותי וכמותי של מבנה שלישוני ¹⁴ ניתן בעקבות כפונקציה של פרמטרים כגון סוג הריכוז יונים, pH, טמפרטורה, או קיפול חלבונים מחייב שיתוף גורמים. שילוב מרתק של פרוטוקול קדימ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Cat#
Sodium Cacodylate(Caution! Toxic)	Sigma-Aldrich	C4945-25g
EDTA (0.5 M)	Ambion	AM9260G
DEPC treated water	Ambion	AM9915G
Sodium Acetate (3 M)	Ambion	AM9740
MgCl2 (1 M)	Ambion	AM9530G
Urea	Ambion	AM9902
Sodium Citrate	Sigma-Aldrich	W302600
tRNA	Sigma-Aldrich	R-7876
Sodium-L-ascorbate	Sigma-Aldrich	A7631-25g
Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O	Sigma-Aldrich	F1543-500g
RNase T1	Fermentas	EN0541
Hydrogen Peroxide (30%)	Sigma-Aldrich	349887