可视化线虫角质层结构的亲脂性的重要染料，直接投资收益

摘要

我们提出了一个可视化生活角质层的方法 C。线虫使用红色荧光亲脂性染料DII（1,1' - 双十八烷基- 3，3,3'，3' - tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐），这是常用的 C。线虫可视化环境接触的神经元。这种优化的协议，alae和环形表皮结构是由DII染色和使用复合显微镜观察。

摘要

角质层的C.线虫是一种高度耐药的结构，周围的^动物 1-4外部。角质层不仅可以保护环境的动物，但也决定体形和蠕动^4-6次的作用。由表皮细胞分泌的几层组成的角质层，包括最外层^的脂质层7。

在角质层的圆周脊称为环空中的模式动物的长度， ^目前在8发展的所有阶段。 Alae有纵脊目前是在特定的发展阶段，包括L1的dauer，和成人阶段^2,9。影响表皮胶原组织的基因突变可以改变表皮结构和动物的身体^形态 5,6,10,11 。虽然使用DIC的光学显微镜复合表皮成像是可行的，目前的方法，突出表皮结构包括荧光^12％的转基因表达，抗体染色，电子显微镜^1。也被用来标记麦胚凝集素（WGA）的可视化表皮糖蛋白，但受限于解决更精细的表皮^结构 14 。使用荧光染料染色表皮表面已被观察到，但从来没有在^细节 15的特点。我们提出了一个方法来可视化角质层在现场 C. 线虫使用红色荧光亲脂性染料DII（1,1' -双十八烷基- 3，3,3'，3' - tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐），也就是通常用于在 C 线虫可视化环境接触的神经元。这是一个简单可靠的方法，高分辨率的荧光可视化的环空中，alae，外阴，男性的尾巴， 在 C和雌雄同体的尾穗DII染色的优化协议线虫 。

研究方案

1。 DII制备染色

1. 准备的20毫克/毫升DII（Biotium公司，公司，海沃德，CA）在DMF原液。 DII是光敏感，所以保护光箔包装DII。
2. 每个人口0.6μLDII股票加入到399.4微升M9的创建工作的DII稀释。这应该给最后的30微克/毫升DII在M9的工作液。这可以扩展多个种群同时染色。盾DII在铝箔包装管（S）。

2。线虫的制备

1. 包含一个未被污染的线虫人口使用60毫米的钢板。洗轻轻摇动整个板面的液体的圆周运动，放松所有的幼虫和成年动物，动物板，解决了0.5％的Triton X - 100的使用M9的缓冲区。转移到无菌1.5毫升管洗。
2. 立即降速在2000转每分钟30秒的动物。取下并丢弃很多SUPernatant尽可能在试管底部，而不会干扰动物的质量。
3. 为了减少残留的TRITON X - 100，冲洗动物使用M9的缓冲区，旋转，去除上清液。重复此步骤一次。
4. 管和涡简要加入400μL的工作DII M9的解决方案，以重悬在溶液中的动物。
5. 摇管在20 ° C水平为3个小时在350 RPM轻保护环境。如果需要的话，动物可以被孵育染色16小时。
6. 为了减少未结合的染料量，自旋向下的动物，在2000转，持续20秒。删除尽可能上清液丢弃，而不会干扰动物的质量。
7. 在400μLM9的缓冲区，并倒到无细菌的接种与OP50 E.一个NGM琼脂板部分液体悬浮动物大肠杆菌 。让动物恢复至少30分钟。在恢复时间的动物应该爬远离DII染色液体到食品。这一步免费直接投资收益减少背景荧光。

3。安装和观察标本

1. 使用高压灭菌器或微波熔体4％水琼脂。
2. 创建可重复使用的垫片，可用于确保琼脂板厚度均匀，分层两件实验室磁带载玻片上。共两个间隔的​​幻灯片。
3. 两个间隔幻灯片之间安排一个洁净的载玻片。移液器熔化的4％到洁净的载玻片中心琼脂约150μL（四滴）。迅速覆盖使用一个额外的幻灯片的形式琼脂垫熔化的琼脂。小心地取下封面幻灯片，安装幻灯片的顶部为中心的垫。
4. 移液器约5μL线虫麻醉（100微米 - 1毫米左旋咪唑，例如，）上垫。
5. 山8 - 12只动物在麻醉剂，并与显微镜的盖玻片覆盖。
6. 使用装有至少40倍objecti的化合物或共聚焦显微镜观察动物 VE和一个DsRed的/ TRITC（或其他兼容）过滤器。激发最大的投资收益为549纳米，其最大发射约束染料（Biotium公司，公司，海沃德，CA）是565纳米。

4。代表性的成果

DII污渍角质层的野生型和突变株C.线虫 。表皮表面含有环空中圆周沟分开，并在某些阶段，纵脊alae。每个发展阶段有^2个不同成分的表皮结构。 alae和环空中的山脊或沟荧光染色，取决于表面成分，整个幼虫和成年阶段，仍然可见使用这种方法恢复后的一天。有时观察到的背景荧光斑点（图2F，G）的，但不是常规（图1，图2A - E，H，我）。所有图像旋转盘共聚焦或时指出，广角（WF）复合显微镜。

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图1。 DII污渍角质层和环境接触的神经元。 L2阶段的动物。 630x放大倍率。马赛克图像部分使用iVision - Mac软件（BioVision的技术，位于宾夕法尼亚州Exton）被抓获。使用Adobe Photoshop CS3（Adobe系统公司，加利福尼亚州圣何塞）加入图像。比例尺= 10微米。 DII还荧光污渍amphid phasmid感觉神经元的头部和尾部分别为（箭头标记一些）。

图2。 DII C.荧光污渍线虫角质层后胚胎发育的各个阶段 。 630x放大倍率。比例尺= 10微米。野生型动物染色）L1，B）二级C）的dauer，D）三级，E）L4;和F）成人阶段。在L1和的dauer动物alae和环形脊荧光染色（A，C）。 DII污渍二级动物的环形脊（二）。环形沟L3和L4动物（D，E）染色。在alae沟和环空中成年动物（FH）的染色。 Alae是由二，五，或三个脊（L1，的dauer，或成年动物，分别）运行长度的动物（箭头^）16。环空中创建圆周周围的动物脊（箭头，F和J）。角质层成人突变动物显示温和的表皮组织缺损（GH）。 G）alae的脊不连续（WF）。高）编外alae脊融合和分支或分叉（WF）。胶原蛋白基因的突变体表现alae和环形组织缺损（IJ）。 i）在过表达转基因动物pRF4（ROL - 6（su1006）），alae谎言脊动物的长度角度。 J）在转基因动物的过度表达pRF4（ROL - 6（su1006））环空中显示一个不规则的图案。

图3。为extern人的形态结构，照亮了DII染色。630x放大倍率。比例尺= 10微米。 DII还突出等外观特征，包括一）成人雌雄同体外阴，B）的成年雄性的尾巴射线和风扇和C）雌雄同体的尾穗（在这种突变的背景分叉）。

图4。角质层需要更长的时间比环境接触的神经元与DII染色。 630x放大倍率。比例尺= 10微米。经过两个小时的染色，amphid（未显示）和phasmid感觉神经元（箭头）有足够的染色。相比之下，年轻动物的角质层只是部分补丁（箭头）染色。

洗	染色解决方案（DII）	孵育时间	角质层染色
M9的± 0.5％TRiton X - 100	M9 + 0.5％的Triton X - 100	2小时	没有
M9 + 0.5％的Triton X - 100	M9 + 0.5％的Triton X - 100	3小时	没有
M9 + 0.5％的Triton X - 100	M9	2小时	部分
M9 + 0.5％的Triton X - 100	M9	3小时	是
M9 + 0.5％的Triton X - 100	H 2 O	2小时	部分
M9 + 0.5％的Triton X - 100	H 2 O	3小时	是

表1。表皮染色，在不同的条件下，各种孵化的解决方案和时间进行了测试，以优化在动物表皮染色。 H _{2 O，}无菌蒸馏水。部分染色表明幼虫角质层片状染色（图4），虽然成人角质层污渍的彗星onsistently。

讨论

这里介绍DII的染色方法，允许一个相对快速和方便的方法来可视化的角质层线虫。再利用和优化常用的图像环境暴露^15,17感觉神经元的方法，直接投资收益可用于荧光染色alae和环状结构（图1和2），以及外阴，男性的尾巴，和雌雄同体的尾穗（图3）。我们发现，洗液和时间的影响的直接投资收益的能力，始终染色的角质层（表1，图4）。 DII染色环境暴露的神经元的方法使用两个小?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂	同义词	公司	目录编号	评论
DII	1,1' - 双十八烷基- 3，3,3'，3' - tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐	Biotium公司，公司	60010	股票稀释： 20 mg / ml的二甲基甲酰胺 工作液：30毫克/毫升
二甲基甲酰胺	二甲基甲酰胺	Sigma - Aldrich公司，公司	D4551
海卫一 X - 100	Octylphenoxypolyethoxyethanol	厂商VWR International，LLC。	EM - 9410
M9	22MM KH 2 PO 4，4200万娜2 HPO 4，86mm的氯化钠，硫酸镁1MM 4
NGM	线虫的生长介质	IPM的科学，公司	11006-501	可以准备以下NGM琼脂协议18
琼脂		电解二氧化锰化工公司	1.01614	4％水
左旋咪唑	盐酸左旋咪唑	Sigma - Aldrich公司，公司	31742	100微米 - 1毫米所需的左旋咪唑
显微镜载玻片		厂商VWR International，LLC。	16005-106
显微镜盖玻片		厂商VWR International，LLC。	16004-302
复方范围		卡尔蔡司公司	A1m	利用的目标，以满足实验的需要
TRITC或其他兼容滤波器	＆NBSP;	色度科技股份有限公司	49005	（ET - DsRed的TRITC/Cy3）溅射过滤器设置