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摘要

粘附频率检测，用于测量当两个分子相互作用的细胞表面锚定受体 - 配体相互作用的动力学描述。使用一个微管加压作为粘附传感器的人体红血细胞和整合αLβ2和细胞间粘附分子-1受体和配体相互作用，这种机械为基础的检测例证。

摘要

微管黏附实验是在1998年开发的，衡量的二维（2D）受体-配体结合动力学。检测使用传感器粘附细胞相互作用的分子之一，并提出一个人的红细胞（RBC）的。它采用显微操作与另一个细胞的表达与精确控制的区域和时间，使债券形成的其他相互作用的分子接触，使红细胞。红细胞伸长后发现，除了拉动两个细胞黏附事件。通过控制固定的红细胞表面上的配体的密度，粘连的概率保持在0和1之间的中档。粘连的概率估计在两个细胞之间的一个给定的接触时间的反复接触，周期序列的粘附事件的频率。不同的接触时间，产生一个具有约束力的曲线。拟合概率模型的结合受体-配体反应动力学1曲线返回2D的亲和力和关闭率。

该试剂盒已通过验证，使用与IgG的Fc 段 1-6，选择素与糖缀合物的配体6-9，与配体10-13 homotypical cadherin 的约束力14，T细胞受体与辅助受体肽主要组织相容性复合物15整合Fcγ 受体的相互作用- 19。

该方法已用于生物物理因素，如膜microtopology 5，膜锚2，分子取向和长度为6，承运人刚度9，曲率20，和撞击力20，以及生化因素，量化的二维动力学的规定，如调制的骨架和膜的微环境相互作用的分子， 这些分子表面，15,17,19组织。

该方法也被用来吨Ø研究并发约束力的双种受体-配体3,4，和19三分子相互作用使用修改后的模型 21 。

该方法的主要优点是，它允许在他们的母语膜环境受体的研究。结果可能会非常不同，从获得使用纯化的受体 17 。它还允许在时间分辨率，远远超出了典型的生化方法分一秒的时间尺度的受体 - 配体相互作用的研究。

要说明的微量粘附频率的方法，我们动力学测量间粘附分子-1（ICAM - 1）红细胞约束力的解决方案中的E -选择与二聚体的中性粒细胞激活α大号β2整合素α大号β2功能。

研究方案

1。从全血红细胞隔离

  1. 准备EAS - 45解决方案。重达从表一的所有成分，并溶于DI水100 200毫升。加水使千毫升解决方案，并调整pH值至8.0。过滤和分装50毫升。冻结储存在-20 ° C。

注：作为一名护士，应当由受过训练的医疗专业等步骤1.2机构审查委员会批准的协议，。

  1. 绘制成10毫升含有EDTA管中位数肘静脉3血5毫升，轻轻混匀血用EDTA，立即彻底避免凝血。
  2. 尽快处理血液样本。离心除以下步骤应该做的引擎盖下，以保持无菌的准备。转移至50ml离心管中的血液，添加5分钟@ 1000RPM，4 ° C的寒冷和无菌Histopaque 1077和离心机10毫升重复两次。
  3. 新增10毫升冷，无菌PBS，离心5分钟@ 1000RPM，4 ° C。去除上清。重复4次（共5次）。
  4. 洗净用无菌EAS - 45（5分钟@ 1000RPM，4℃）的两倍。在过去的洗涤红细胞移动到一个新的无菌15毫升管。
  5. 悬浮红细胞in10ml EAS - 45。

2。红细胞生物素

  1. 以与步骤1中红细胞管。取出后5分钟@ 1000RPM，4 ° C离心上清红细胞沉淀中加入10μl到每个几个小瓶，并添加相应数额的PBS，每小瓶（例如准备六种不同的红细胞生物素浓度表二） 。
  2. 根据表二 ，做出新的Biotin-X-NHS/DMF 1:10，1:100稀释。
  3. 添加0.1M硼酸缓冲液中加入10μl每一瓶。
  4. 添加生物素的解决方案，以每一瓶（见如表二 ）的计算量和涡立即。
  5. 将每个红细胞小瓶一个50ml的锥形管和肩在室温下孵育30分钟内。
  6. 每一瓶洗净800μl的EAS - 45为2分钟@ 2000RPM的3倍。
  7. EAS - 45100μL每一瓶和储存于4 ° C。现在应该在每一个最终的解决方案的加入1μl〜1mln的红细胞。

3。 Functionalizing红细胞的生物素联配体*

  1. 根据制造商的指示，准备2mg/ml链亲和素溶液。 Aliqouted解决方案可能会储存在-20 ° C
  2. 从步骤2.7（10μL）混合等量的红细胞与链霉亲和素溶液，旋涡立即孵育30min后上肩在4 ° C。
  3. 2分钟@ 2000RPM的EAS - 45500μL洗3次。加入15μlEAS - 45 / 1％BSA的存储。
  4. 20μg/ml配体解决方案，涡（10μL）从步骤3.3混合等量的红细胞和肩在室温下孵育30分钟。
  5. 洗两次，500μLEAS -45 / 1％BSA为2分钟@ 2000RPM。 EAS - 45 / 1％的存储BSA的加入15μl。

*如果你的蛋白没有生物素的链接，您可以使用市售蛋白质生物素包（例如，Thermo Scientific的＃21955 EZ - Link的微型NHS - PEG4 -生物素包），或使用生物素捕获抗体作为一个中间步骤，如下所示在视频中。

4。受体与配体密度的定量

  1. 从第3步孵育配体涂层的红细胞，在不同的小瓶，受体含饱和浓度与各自的单克隆抗体的细胞在室温下30分钟。在单独的小瓶无关匹配的同型对照抗体细胞孵育。如果没有荧光标记的抗体，荧光标记的二抗孵育，根据制造商的指示。
  2. 分析步骤4.1准备流式细胞术样品与相应的荧光CALibration珠。计算图所示的密度。 1。

5。为微管的制备和细胞室

  1. 拉使用PN - 30 Narishige“磁性玻璃微电极水平拖轮或萨特仪器微管拖轮毛细管微量。
  2. 使用与microforge显微拉微量调整到所需的大小（通常所需的直径范围从1 -5μm的，要在研究中使用的细胞的大小而定）的提示。
  3. 准备削减到所需的大小显微镜盖玻片的细胞室。密封腔，从双方使用矿物油，以避免介质的蒸发，在实验过程中改变渗透压。
  4. 新增的受体和配体细胞会议厅。

6。微管粘附频率检测

  1. 各自移液器吸相互作用的细胞，并用计算机编程piezoelectr IC翻译驱动与控制的接触面积和时间与其他细胞接触和红细胞。检测细胞分离后，通过观察红细胞伸长的粘附事件。
  2. 对于一个给定的接触时间，重复接触回缩周期50-100倍。在Excel电子表格的列无粘连粘连或“0”，加入“1”，记录所观察到的粘附性事件。您可以使用录音设备，如数字媒体或录像带，显微图像。
  3. 记录每个接触的时间至少有三个不同的细胞对获得的均值和SEM的附着力频率与接触时间曲线。
  4. 使用无关配体（如BSA），和/阻止使用其特定的功能封锁单克隆抗体的配体或受体或涂红细胞记录控制的非特异性的结合曲线。在每个接触时间点的特异性粘附频率可以计算出清除非特异性粘附频率 1 。
ove_title“> 7。数据分析

  1. 适合具体的附着力频率 P A与接触时间T的数据概率模型（公式1），介绍了二阶和一阶扭转，单步之间相互作用的受体和配体 1，品种单一品种单一：
    figure-protocol-2644
    其中 K 2D有效的结合亲和力，K关闭的关闭率，M r 和 M，L，分别是受体与配体密度在第4步测， 和 C的接触面积。曲线拟合有两个参数， 一个 C K 一 K 关闭 ， 作为 C 和 K 一个混为一谈，并呼吁有效2D的亲和力集体。其关闭率的产品是有效的2D率： > C 钾 = A C K 一个X k。
    特异性粘附频率P的计算方法是从总的测量粘附性（P）1,21（非特异性）的非特异性粘附分数加减：
    figure-protocol-3236

8。代表性的成果：

figure-protocol-3367
图1整合α 大号β2中性粒细胞的站点密度的测定。中性粒细胞E -选择素，免疫球蛋白为10分钟1μg/ml培养相匹配的实验条件下，在数字3,4或没有E -选择素，免疫球蛋白，然后用饱和浓度PE标记的抗（10μg/ml）人类CD11a单克隆抗体（克隆HI111， 具体表试剂和设备）或无关控制鼠IgG1，洗净，并立即进行分析。样品读取BD LSR与标准的QuantiBRITE PE校准珠的流式细胞仪。 A组荧光直方图显示校准珠（粉红色）与E -选择素免疫球蛋白治疗（蓝色）或未经处理的细胞（绿色）。具体CD11a单克隆抗体染色所示的实线和虚线所示无关亚型对照抗体染色。与E -选择素- IG（所有洗涤步骤，在流式细胞仪缓冲）处理的细胞没有影响CD11a密度，与未经处理的细胞相比。 B组显示密度定量的过程。 LOG10计算的平均荧光强度（FI）的每四个校准珠小组直方图峰值（粉红色圆圈）和（制造商）为每珠的很多特定的PE分子。一个线性回归LOG10 PE分子每珠对LOG10 fluorescENCE绘制。 E -选择素处理的细胞的LOG10 FI（Y）值等于3.99（蓝色实心圆）和2.23（蓝色空心圆），为特定的人与生物圈计划和控制抗体，respectivly。我们解决了X（值B组的绿色和蓝色圆圈绘制）的线性方程X = LOG10 PE /细胞，如PE：单克隆抗体的比例为1:1，α大号β2中性粒细胞总数计算为9587。面密度计算为43个分子/ 微米 2，中性粒细胞直径 228.4μm 。 ICAM - 1的密度同样测流cytometery使用PE抗人CD54的单克隆抗体，这相当于65摩尔/微米2。

figure-protocol-4291
图2 微管系统原理图 。我们的微管系统是在内部装配和三个子系统组成：影像子系统，让一个观察，建议条例和分析微量吸气细胞的运动;一个显微子系统，使一个选择的细胞从细胞室，压力子系统，让吸进微量的细胞。成像子系统的核心部分是一个100X的油浸1.25 NA目标倒置显微镜（奥林巴斯IMT - 2 IMT2）。通过电荷耦合器件（CCD）摄像机，图像传送到录像机。视频定时器耦合系​​统的跟踪时间。每个微管可以由机械驱动器安装在显微镜和精细定位与三轴液压显微操纵。以及可用于从新港机械造。微量持有人之一，是安装在压电翻译，其中的驱动程序是通过电压放大器（自制），压电执行器控制计算机LabVIEW代码（根据要求提供），并通过数据采集板的信号转换。这是一个llows之一附着力测试周期的移动吸管，精确和可重复。压力调节子系统是用来控制在实验过程中的吸力。液压线连接到储液罐的微量持有人。一个优良的机械定位，使水库的高度精确的操纵。

微量移液器使用KIMAX熔点高硼硅玻璃（外径1.0 ± 0.07毫米，内径0.7 ± 0.07毫米毛细管生成首先，从毛细管微量使用PN - 30 Narishige“磁性玻璃微电极技术水平拖轮拉（萨特仪器微管拖轮是另一个拉马选项）。二，Microforge系统（造房子）是用来切割到所需的大小开幕微量。Microforge系统的商业模式以及。

为了避免在实验过程中，显微的振动的微量OPE，以及与micromanipulators，被放置在一个空气悬架表。

figure-protocol-5106
图3运行粘附频率 F 我具体（一）和非特异性（二）1（红色）和具有约束力10S（蓝色）接触测量与ICAM - 1（A）或hIgG涂层的红细胞粘附之间的反复测试周期的时间（二人中性粒细胞表达整合的α大号β2）F的第 I =（X 1 + X 2 + ... ... + X I）/ I（1≤我≤N），其中 i是试验周期指数，X i等于“1 “ （粘连）或“0”（无粘连），F N（N = 50）被用来作为最佳估计粘连的概率。

figure-protocol-5587
图4动力学ICAM - 1结合，以中性粒细胞整合素α 大号β2（ figure-protocol-5713 ）。附着力的概率测量在每个接触时间的细胞对图3所示是平均，并与接触时间绘制。腔介质为1MM的Ca 2 +和Mg 2 +加1μg/ml的二聚体E -选择素免疫球蛋白的HBSS上调α 大号β2结合。为了捕捉ICAM - 1的免疫球蛋白，对红细胞增加了一个中间步骤，孵化链亲和素孵育阶段后的捕获抗体（生物素化山羊抗人Fc的抗体，eBioscience公司）10μg/ml红细胞。为了控制非特异性结合两种不同的条件：1）红细胞与抗人FC捕获抗体涂层和ICAM - 1 - IG（海外）和2）中性粒细胞到红细胞结合，而不是与人IgG孵育与涂层捕获抗体（Δ）。 10μg/ml人IgG添加到中期，以尽量减少E的有约束力- 选择免疫球蛋白溶液中的红细胞表面上的捕获抗体。非特异性结合人IgG控制曲线记录被用来获得一个特定的粘附概率曲线（ figure-protocol-6166 ）式。 2。配件特异性粘附EQ概率曲线。 1（实线）返回有效的结合亲和力一个 c K = 1.4•10 -4μm4 和 K关闭= 0.3 秒 -1 。

试剂兆瓦（克/摩尔） 浓度（毫米） 量（g）
腺嘌呤 135.13 2 0.27
D -葡萄糖（葡萄糖） 180.16 110 19.82
D -甘露醇 182.17 55 10.02
氯化钠（NaCl） 58.44 50 2.92
磷酸钠，磷酸氢二铵（NA HPO ） 141.95 20 2.84
L -谷氨酰胺 146.15 10 1.46

表1的EAS - 45缓冲液配制（1L）。

在550μL的DMF XHS 25毫克生物素 0.1M素的解决方案
0.1生物素W / DMF 1:10稀释 0.01M素溶液
1:100稀释的0.1素W / DMF 0.001M素溶液

表2。制备生物素的解决方案。

素终浓度（微米） 4 10 20 50 100 160
红细胞颗粒股票（μL） 10 10 10 10 10 10
1X PBS（μL） 179.2 178 176 179 178 176.8
0.1M硼酸缓冲液（μL） 10 10 10 10 10 10
0.01M素溶液（μL） 1 2 3.2
0.001M素溶液（μL） 0.8 2 4

表3。红细胞生物素。

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讨论

要成功使用微管粘附频率检测应考虑的几个关键步骤。首先，确保记录的具体利益的受体 - 配体系统的相互作用。非特异性控制测量（参见图3，4）保证的特殊性。理想的情况下，非特异性黏附概率应低于0.05，对所有接触的时间段，每个时间点之间的特异性和非特异性黏附概率有显著差异。不同的方法可以用来夫妇的红细胞表面的配体。结果表明，氯化铬耦合方法17了非特异性结合的生物...

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披露声明

没有利益冲突的声明。

致谢

这项研究是由NIH的拨款R01HL091020，R01HL093723，R01AI077343，并R01GM096187支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
试剂名称公司目录＃ 评论
10X PBS BioWhittaker

17 - 517Q

用去离子水稀释到1X使用前
Vacutainer EDTA 屋宇署 366643 红细胞隔离
10ML PK100
Histopaque 1077 Sigma - Aldrich公司 10771 红细胞隔离
腺嘌呤 Sigma - Aldrich公司 A2786 EAS - 45准备
D -葡萄糖（葡萄糖） Sigma - Aldrich公司 G7528 EAS - 45准备
D -甘露醇 Sigma - Aldrich公司 6360 EAS - 45准备
氯化钠（NaCl） Sigma - Aldrich公司 S7653 EAS - 45准备
磷酸三钠，磷酸氢二铵（娜＆＃X2082; HPO₄） Fisher Scientific则 S374 EAS - 45准备
L -谷氨酰胺 Sigma - Aldrich公司 G5763 EAS - 45准备
生物素 - X - NHS Calbiochem 203188 红细胞生物素
二甲基甲酰胺（DMF） Thermo Scientific的 20673 红细胞生物素
硼酸盐缓冲液（0.1M） 电子显微镜科学 11455-90 红细胞生物素
链霉亲和素 Thermo Scientific的 21125 配体functionalizing
牛血清白蛋白 Sigma - Aldrich公司 A0336 配体functionalizing
Quantibrite体育珠 BD公司 340495 密度定量
流式细胞仪屋宇署Immunocytometry系统

BD LSR II

密度泉tification

毛细管

0.7 - 1.0MM × 30“ 		金布尔玻璃公司 46485-1 微管拉
矿物油 Fisher Scientific则 BP2629 - 1 商会大会
显微镜盖玻片 Fisher Scientific则 12 - 544 - G 商会大会

聚乙烯α-人类CD11a

克隆您好111 		eBioscience公司 12-0119-71 试剂图
PE抗人类CD54的 eBioscience公司 12-0549 试剂图
鼠IgG1同型对照PE eBioscience公司 12-4714 试剂图
液压显微 Narishige MO - 303 微管系统
机械手新港 461 - XYZ - M，SM - 13，DM - 13 微管系统
压电翻译玛格力Instrumente P - 840 微管系统
LabVIEW的美国国家仪器公司 8.6版微管系统
DAQ板美国国家仪器公司 USB - 6008 微管系统
光学平台动力学系统 5200系列微管系统

参考文献

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