Ensaio de aderência de freqüência para In Situ Análise Cinética de Cross-juncional interações moleculares na interface célula-célula

Resumo

Um ensaio de freqüência de adesão para medir cinética de interação receptor-ligante, quando ambas as moléculas estão ancoradas nas superfícies das células que interagem é descrito. Este ensaio mecanicamente baseado é exemplificado usando uma micropipeta pressurizado glóbulo vermelho humano como sensor de adesão e integrinas αLβ2 e molécula-1 de adesão intercelular como interagindo receptores e ligantes.

Resumo

O ensaio de adesão micropipeta foi desenvolvido em 1998 para medir a duas dimensões (2D) receptor-ligante cinética de ligação ^1. O ensaio utiliza uma célula vermelha do sangue humano (RBC) como sensor de adesão e apresentar célula de uma das moléculas que interagem. Ela emprega micromanipulação para trazer o RBC em contato com outra célula que expressa a molécula de interagir com outras área controlada com precisão e tempo para permitir a formação de vínculo. O evento de adesão é detectado como alongamento RBC em cima puxando as duas células separadas. Ao controlar a densidade dos ligantes imobilizados na superfície RBC, a probabilidade de adesão é mantido em mid-range entre 0 e 1. A probabilidade de adesão é estimada a partir da freqüência de eventos de aderência em uma seqüência de ciclos de repetição do contato entre as duas células de um determinado tempo de contato. Variando o tempo de contato gera uma curva de ligação. Montagem de um modelo probabilístico para o receptor-ligante reação cinética de ¹ a a ligaçãocurva retorna a afinidade 2D e desconto na tarifa.

O teste foi validado usando interações de receptores Fcγ com IgG Fc ^1-6, selectinas com ligantes glicoconjugada ^6-9, integrinas com ligantes ^10-13, homotypical caderina vinculativo ^14, T receptor celular e co-receptor com complexos peptídeo-major de histocompatibilidade ^{15 - 19.}

O método tem sido utilizado para quantificar os regulamentos da cinética 2D por fatores biofísicos, tais como a membrana microtopology ^5, membrana âncora ^2, orientação molecular e comprimento ^6, rigidez transportadora ^{9, 20} curvatura, e força impingement ^20, bem como os fatores bioquímicos, tais como moduladores do microambiente citoesqueleto e membrana onde as moléculas interagem e reside na organização superfície dessas moléculas ^15,17,19.

O método também foi usado to estudo a ligação simultânea de dupla receptor-ligante ^3,4 espécies e interações trimolecular ¹⁹ usando um modelo modificado ^21.

A principal vantagem do método é que ele permite estudo de receptores de membrana em seu ambiente nativo. Os resultados poderiam ser muito diferentes daqueles obtidos com receptores purificada ^17. Ele também permite estudo das interações receptor-ligante em uma escala de tempo sub-segundo, com resolução temporal muito além dos métodos típicos bioquímicos.

Para ilustrar o método de freqüência de adesão micropipeta, mostramos a cinética de medição da molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) em hemácias funcionalizados ligação a integrina β α _{L 2} em neutrófilos com dimérica E-selectina na solução para ativar α β _{L 2.}

Protocolo

1. RBCs isolamento do sangue total

1. Prepare EAS-45 soluções. Pesar até todos os ingredientes da Tabela I e dissolver em 100-200ml de água DI. Adicionar água para fazer a solução de 1000ml e ajustar o pH para 8,0. Filtrar e alíquota, de acordo 50ml. Congelar a -20 ° C para armazenamento.

Nota: Passo 1.2 deve ser realizada por um médico treinado profissional, como enfermeira, com um Conselho de Revisão Institucional protocolo aprovado.

2. Desenhe 3-5ml de sangue da veia cubital mediana em um tubo de 10 ml contendo EDTA e delicadamente misturar o sangue com EDTA imediata e cuidadosamente para evitar a coagulação.
3. Processo de amostra de sangue o mais rapidamente possível. Todos os passos a seguir, exceto centrifugação deve ser feita sob o capô para manter a preparação estéril. Transferir o sangue para um tubo de centrífuga 50ml, adicione 10 ml de Histopaque frio e estéril 1077 e centrifugar por 5 min @ 1000 rpm, 4 ° C. Repita duas vezes.
4. Adicionar 10ml frio e estéril PBS, centrifugue por 5min @ 1000 rpm, 4 ° C. Retire o sobrenadante. Repita 4 vezes (total de 5 vezes).
5. Lavar com estéril EAS-45 (5min @ 1000 rpm, 4 ° C) duas vezes. Durante os últimos RBCs mover de lavagem para um novo tubo estéril 15ml.
6. Ressuspender RBCs in10ml EAS-45.

2. Biotinilação RBCs

1. Pegue o tubo com hemácias a partir do passo 1. Remover todas as sobrenadante após a centrifugação para 5min @ 1000 rpm, 4 ° C. Coloque 10μl de hemácias pellet a cada um dos vários frascos e adicionar uma quantidade correspondente de PBS a cada frasco (ver Tabela II, por exemplo, de preparação de seis diferentes concentrações de hemácias Biotinilação).
2. Faça novos Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 diluições de acordo com a Tabela II.
3. Adicionar 10μl de tampão borato 0,1 M para cada frasco.
4. Adicionar montante calculado de solução biotina para cada frasco (ver Tabela II como exemplo) e vortex imediatamente.
5. Coloque cada frasco RBCdentro de um tubo cônico de 50ml e incubar no rotador por 30min em temperatura ambiente.
6. Lave cada frasco 3 vezes com 800μl de EAS-45 para 2min @ 2000 rpm.
7. Adicionar 100μl da EAS-45 para cada frasco e armazenar a 4 ° C. Em cada 1μl da solução final deve ser agora ~ 1mln de hemácias.

3. Funcionalização da biotina ligada * ligantes na RBCs

1. Prepare 2mg/ml solução estreptavidina de acordo com instruções do fabricante. Aliqouted solução pode ser armazenada a -20 ° C.
2. Misture uma quantidade igual de glóbulos vermelhos a partir do passo 2.7 (10μl) com estreptavidina solução, imediatamente vortex e incubar no rotador por 30min a 4 ° C.
3. Lavar 3 vezes com 500μl de EAS-45 para 2min @ 2000 rpm. Adicionar 15μl EAS-45 / 1% BSA para armazenamento.
4. Mix igual quantidade de glóbulos vermelhos a partir do passo 3.3 (10μl) com solução de ligante 20μg/ml, imediatamente vortex e incubar no rotador por 30min em temperatura ambiente.
5. Lave duas vezes com 500μl de EAS-BSA 45 / 1% para 2min @ 2000 rpm. Adicionar 15μl de BSA EAS-45 / 1% para armazenamento.

* Se sua proteína não tem nenhuma ligação biotina você pode usar um dos kits disponíveis comercialmente para Biotinilação proteína (por exemplo, Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Kit Micro NHS-PEG4 Biotinilação) ou usar biotinilado anticorpos captura como um passo intermediário, como mostrado no vídeo.

4. Quantificação da densidade do receptor e ligante

1. Incubar ligante revestido hemácias a partir do passo 3 e, em diferentes frasco, receptor-rolamento células com concentrações de saturação de mAbs respectivos por 30min em temperatura ambiente. Incubar em celas separadas frascos com irrelevantes isotipo pareados anticorpos para o controle. Se os anticorpos primários não são etiquetadas fluorescente, fluorescente incube com anticorpos conjugados secundários de acordo com instruções do fabricante.
2. Analisar amostras preparada no passo 4.1 por cytometery fluxo com correspondentes fluorescentes calbração contas. Calcular as densidades como mostrado na figura. 1.

5. Preparação para micropipeta e câmara de celular

1. Puxe micropipetas de tubos capilares usando PN-30 Narishige 'Puller microeletrodos Magnetic Vidro Horizontal ou Sutter Instruments Micropipeta Puller.
2. Use micromanipulador com microforge para ajustar a ponta da micropipeta puxado para o tamanho desejado (geralmente o diâmetro necessário varia de 1-5m, dependendo do tamanho das células para ser utilizada no estudo).
3. Prepare a câmara de célula cortando tampa de vidro do microscópio para o tamanho desejado. Vedação da câmara utilizando óleo mineral de ambos os lados para evitar a evaporação média para mudar a osmolaridade durante o experimento.
4. Adicione a células receptoras e de suporte de ligante para a câmara.

6. Micropipeta ensaio de freqüência de adesão

1. Aspirar as células interagindo por pipetas respectivos e uso do computador programado piezoelectr Tradutor ic para conduzir o RBC dentro e fora de contato com a outra célula com área de contato controlado e tempo. Detectar eventos de adesão, observando alongamento RBC sobre separação de células.
2. Repetir o ciclo de contato-retração 5-10 vezes para um tempo de contato fornecido. Registrar os eventos de adesão observado pela adição de "1" para a adesão ou "0" para não adesão em uma coluna de planilha Excel. Você pode usar um dispositivo de gravação, por exemplo, a mídia digital ou fita de vídeo, para as imagens microscópicas.
3. Registrar a freqüência de aderência versus a curva do tempo de contato com pelo menos três pares de células diferentes para cada tempo de contato para obter uma média e SEM.
4. Registro da curva de inespecífica para o controle usando hemácias revestidas com ligantes irrelevantes (por exemplo BSA) e / ou bloquear os receptores ou ligantes específicos usando seus mAbs bloqueio funcional. Freqüência de adesão específicas em cada ponto de tempo de contato pode ser calculado pela remoção da freqüência de adesão inespecífica ^1.

ove_title "análise> 7. Dados

1. Fit a freqüência específica de adesão P _uma relação de contato de dados em tempo t por um modelo probabilístico (Equação 1) que descreve uma segunda ordem para a frente e de primeira ordem inversa, a interação de um único passo entre uma única espécie de receptores e uma única espécie de ligantes ^um :
   
   onde K _a é a afinidade de ligação eficaz 2D, k _off é o desconto na tarifa, m _r e m _l são os respectivos receptores e densidades ligante medida no passo 4, e A _c é a área de contato. A curva de ajuste tem dois parâmetros, A _c K _a k e _fora, como um _C e _um K são agrupados e chamados coletivamente como afinidade 2D eficaz. Seu produto com o desconto na tarifa é a taxa efetiva 2D-on: A _c k = A _{em c} K _a k x _off.
   A freqüência específica de adesão P _a é calculado pela subtração da fração de adesão inespecífica (P _{inespecíficos)} da adesão total medidos _(medidos P) ^1,21:
   

8. Resultados representativos:

Figura 1 Determinação da integrina β _{2 L} α densidade site em neutrófilos. Neutrófilos foram primeiro incubadas com 1μg/ml de E-selectina-Ig de 10min para coincidir com a condição experimental utilizada nas Figuras 3,4 ou sem E-selectina-Ig, e depois com as concentrações de saturação (10μg/ml) de conjugado anti-PE -humano CD11a mAb (Clone HI111, consulte a Tabela de específicasreagentes e equipamentos) ou rato IgG1 irrelevante para controle, lavados, e analisadas imediatamente. As amostras foram lidas no citômetro de fluxo BD LSR com o padrão QuantiBRITE contas calibração PE. Um painel mostra os histogramas de fluorescência de contas de calibração (rosa), juntamente com os de E-selectina-Ig células tratadas (cor azul) ou sem tratamento (cor verde). Específicas CD11a coloração mAb é mostrado nas curvas de sólidos e coloração do anticorpo irrelevante isotipo controle pareados é mostrado nas curvas pontilhadas. Células tratadas com E-selectina-Ig (presença em todas as etapas de lavar e em tampão FACS) não afetou a densidade CD11a como pode ser visto a partir da comparação com células não tratadas. Painel B mostra o processo de quantificação de densidade. Log10 foi calculado para a intensidade média fluorescente (FI) de cada valor de pico de quatro histogramas talão de calibração a partir do Painel A (círculos cor de rosa) e para as moléculas muito específicas PE por talão (do fabricante). Uma regressão linear de moléculas Log10 PE por talão contra Log10 fluoresccia foi plotada. Por E-selectina células tratadas a Log10 FI (y) valores iguais 3,99 (círculo sólido azul) e 2.23 (círculo aberto azul) para mAb específico e anticorpo controle, respectivly. Resolvemos a equação linear de x (os valores são representados como círculos verde e azul no painel B) x = Log10 PE / célula e, como PE:. MAb proporção de 1:1, o número total de α β _{L 2} em neutrófilos foi calculado como 9587. Densidade de superfície foi calculada em 43 moléculas / M ^2, usando 8.4μm como o diâmetro de neutrófilos ^22. Densidade de ICAM-1 foi igualmente medido pelo cytometery de fluxo, utilizando-PE anti-CD54 humano mAb, que igualou 65 mol / M ^2.

Figura 2 sistema de esquemas Micropipeta. Nosso sistema de micropipeta foi montado em casa e é composto por três subsistemas: um subsistema de imagem para permitir que se observe, record e analisar os movimentos da célula micropipeta de aspiração; um subsistema de micromanipulação para habilitar uma para selecionar as células da câmara de célula, e um subsistema de pressão para permitir uma para aspirar as células em micropipetas. A peça central do subsistema de imagem é invertida microscópio (Olympus IMT-2 IMT2) com um óleo de imersão 100x 1,25 NA objetivo. A imagem é enviada para um gravador de vídeo através de um dispositivo casal de carga (CCD) da câmera. Um temporizador de vídeo é acoplado ao sistema para manter a noção do tempo. Cada micropipeta pode ser manipulado por um acionamento mecânico montado no microscópio e finamente posicionado com um micromanipulador de três eixos hidráulicos. Manipuladores mecânicos de Newport poderia ser usado também. Um dos titulares micropipeta é montado em um tradutor piezoelétrico, o condutor de que é controlado por um computador LabView código (disponível a pedido) e os traduz sinal através de uma placa DAQ através de um amplificador de tensão (caseiro) para o atuador piezo. Este umllows um para mover a pipeta de forma precisa e repetidamente em um ciclo de teste de aderência. O subsistema de regulagem de pressão é usado para controle de sucção durante o experimento. A linha hidráulica conecta o titular micropipeta para um reservatório de fluido. Um posicionador fino mecânica permite que a altura do reservatório a ser manipuladas com precisão.

Micropipetas são gerados usando a fusão KIMAX ponto de tubos de vidro borossilicato capilar (com diâmetro externo de 1,0 ± 0,07 mm e um diâmetro interno de 0,7 ± 0,07 mm. Primeiro, o micropipetas de tubos capilares são puxados usando PN-30 Narishige 'Puller microeletrodos Magnetic Vidro Horizontal (Sutter Instruments Micropipeta Puller é outra opção extrator). Em segundo lugar, o sistema Microforge (construído em casa) é usado para cortar o micropipetas para a abertura tamanho desejado. Commercial modelos de sistemas de Microforge também estão disponíveis.

Para evitar a vibração do micropipetas durante o experimento, o Microscope, juntamente com o micromanipuladores, é colocado em uma mesa de suspensão a ar.

Figura 3 Executando F freqüência de adesão específica para _i (A) e inespecíficos (B) ligação em 1s (vermelho) e 10s vezes (azul) de contato medido a partir de ciclos repetidos de adesão de teste entre hemácias revestidas com ICAM-1 (A) ou hIgG (B ) com neutrófilos humanos expressando integrina α β _{L 2.} F _i = (X ₁ + X ₂ + ... + X _i) / i (1 ≤ i ≤ n), onde i é o índice de ciclo de teste, X _i é igual a "1" (aderência) ou "0" (sem adesão). F _n (n = 50) foi usado como a melhor estimativa para a probabilidade de adesão.

Figura 4 Cinética deICAM-1 vinculativo para neutrófilos integrina β _L α ₂ ( ). Probabilidade de adesão, como indicado na Figura 3 para três pares de células em cada tempo de contato é média e plotados versus tempo de contato. O meio de câmara foi HBSS com 1mm de cada um de Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +,} mais 1μg/ml dimérica de E-selectina-Ig para upregulate α β _{L 2} vinculativo. Para capturar ICAM-1-Ig de hemácias, uma etapa intermediária foi adicionado para incubar hemácias com anticorpos de captura de 10μg/ml (biotinilado de cabra anti-anticorpo humano Fc, eBioscience) após a etapa de incubação estreptavidina. Para controlar inespecífica duas condições diferentes foram utilizados: 1) hemácias revestidas com o anticorpo de captura anti-humano Fc e incubadas com IgG humana em vez de ICAM-1-Ig (O) e 2) neutrófilos ligação a eritrócitos não revestidos com o captura de anticorpos (Δ). 10μg/ml IgG humana foi adicionadas ao meio de minimizar ligação de E-Selectina-Ig em solução para o anticorpo de captura na superfície RBC. Ligação não específica registrada como curva de controle humano IgG foi utilizado para obter uma curva de probabilidade específica de adesão ( ) Usando a equação. 2. Curva de probabilidade de montagem específicas de adesão com a Eq.. 1 (linha contínua) retornou afinidade de ligação eficaz A K _{c a} = 1,4 • 10 ^-4 e μm4 k _off = 0,3 s ^-1.

Reagente	MW (g / mol)	Concentração (mM)	Quantidade (g)
Adenina	135,13	2	0,27
D-glicose (dextrose)	180,16	110	19,82
D-Manitol	182,17	55	10,02
Cloreto de sódio (NaCl)	58,44	50	2,92
Fosfato de sódio dibásico (Na HPO )	141,95	20	2,84
L-glutamina	146,15	10	1,46

Preparação tabela 1. EAS-45 buffer (1L).

25 mg biotina-XHS em 550 mL de DMF	0,1 M solução de biotina
Diluição de 1:10 de 0,1 biotina w / DMF	0,01 M solução de biotina
Diluição 1:100 de 0,1 biotina w / DMF	0,001 m solução de biotina

Tabela 2. Preparação da solução de biotina.

biotina concentração final (M)	4	10	20	50	100	160
RBCs pellet de ações (mL)	10	10	10	10	10	10
1x PBS (mL)	179,2	178	176	179	178	176,8
0,1 M de borato tampão (mL)	10	10	10	10	10	10
0,01 M biotina solução (mL)				1	2	3,2
0,001 m biotina solução (mL)	0,8	2	4

Tabela 3. Biotinilação de hemácias.

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Discussão

Para usar com sucesso o ensaio de micropipeta freqüência de adesão deve-se considerar várias etapas críticas. Primeiro, certifique-se de registrar a interação específica para o sistema de receptor-ligante de interesse. Medidas de controle não-específica (cf. fig. 3, 4) garantir a especificidade. Idealmente, as probabilidades de adesão não específica deve ser inferior a 0,05 para todas as durações de tempo de contato e ter uma diferença significativa entre as probabilidades de adesão específicas e não ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Catálogo #	Comentários
PBS 10x	BioWhittaker	17-517Q	Diluir a 1x com água deionizada antes do uso
Vacutainer EDTA	BD	366643	Isolamento RBCs
10ML PK100
Histopaque 1077	Sigma-Aldrich	10771	Isolamento RBCs
Adenina	Sigma-Aldrich	A2786	EAS-45 de preparação
D-glicose (dextrose)	Sigma-Aldrich	G7528	EAS-45 de preparação
D-Manitol	Sigma-Aldrich	6360	EAS-45 de preparação
Cloreto de sódio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	EAS-45 de preparação
Fosfato de sódio dibásico (Na & # x2082; HPO ₄)	Fisher Scientific	S374	EAS-45 de preparação
L-glutamina	Sigma-Aldrich	G5763	EAS-45 de preparação
Biotina-X-NHS	Calbiochem	203188	Biotinilação RBCs
Dimetilformamida (DMF)	Thermo Scientific	20673	Biotinilação RBCs
Borato tampão (0,1 M)	Microscopia Eletrônica de Ciências	11455-90	Biotinilação RBCs
Estreptavidina	Thermo Scientific	21125	Ligante funcionalização
BSA	Sigma-Aldrich	A0336	Ligante funcionalização
Beads Quantibrite PE	BD Biosciences	340495	Quantificação da densidade
Citômetro de fluxo	BD Immunocytometry Sistemas	BD LSR II	Densidade quantificação
Tubo capilar 0.7-1,0 milímetros x 30 "	Kimble Glass Inc.	46.485-1	Micropipeta puxando
Óleo mineral	Fisher Scientific	BP2629-1	Câmara de montagem
Tampa de vidro de microscópio	Fisher Scientific	12-544-G	Câmara de montagem
PE α-humano CD11a Clone HI 111	eBioscience	12-0119-71	Reagente para Fig.1
PE anti-CD54 humano	eBioscience	12-0549	Reagente para Fig.1
IgG1 Isotype Controle PE	eBioscience	12-4714	Reagente para Fig.1
micromanipulador hidráulico	Narishige	MO-303	Micropipeta sistema
Manipulador mecânico	Newport	461-xyz-m, SM-13, DM-13	Micropipeta sistema
Tradutor piezoelétrico	Physik Instrumente	P-840	Micropipeta sistema
LabVIEW	National Instruments	Versão 8.6	Micropipeta sistema
DAQ bordo	National Instruments	USB-6008	Micropipeta sistema
Tabela óptica	Cinética de Sistemas	5200 Series	Micropipeta sistema