תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

Summary

תדירות הדבקה assay למדידת קולטן ליגנד קינטיקה אינטראקציה כאשר הן מולקולות מעוגנים על פני השטח של התאים אינטראקציה מתוארת. Assay זה מכני מבוסס מודגמת באמצעות micropipette-בלחץ דם אנושי תא אדום כמו חיישן הידבקות integrin αLβ2 ו מולקולה-1 הדבקה אינטר כמו אינטראקציה קולטנים ligands.

Abstract

Assay הידבקות micropipette פותחה בשנת 1998 על מנת למדוד דו ממדי (2D) קולטן ליגנד קינטיקה מחייב ^1. Assay משתמשת תא אנושי דם אדומים (RBC) כמו חיישן הידבקות התא הצגת אחד של מולקולות אינטראקציה. היא מעסיקה המיקרומניפולציה להביא את RBC במגע עם תא אחר המבטא את המולקולה אינטראקציה עם אחרים לאזור שבשליטת בדיוק הזמן כדי לאפשר היווצרות הקשר. האירוע הידבקות מזוהה כמו התארכות RBC על משיכת שני תאים בנפרד. על ידי שליטה על צפיפות של ligands משותקת על פני השטח RBC, ההסתברות של הידבקות נשמר בטווח אמצע בין 0 ל -1. ההסתברות הידבקות מוערך של תדירות האירועים הידבקות ברצף מחזורים חוזרים ונשנים ליצור קשר בין שני תאים לזמן קשר נתון. משנים את זמן מגע יוצר עקומת מחייב. התאמת מודל הסתברותי לתגובת קולטן ליגנד קינטיקה ¹ ל מחייבעקומת מחזירה את הזיקה 2D and off-קצב.

Assay יאומת באמצעות אינטראקציות של רצפטורים Fcγ עם IgG Fc ^1-6, selectins עם ligands glycoconjugate ^{6-9, 10-13} integrins עם ligands, homotypical cadherin מחייב ^14, קולטן T התא coreceptor עם פפטיד הגדולות מתחמי histocompatibility ^{15 - 19.}

בשיטה נעשה שימוש כדי לכמת תקנות קינטיקה 2D ידי גורמים biophysical, כגון הממברנה microtopology ^5, קרום עוגן ^2, אוריינטציה מולקולרית באורך ^6, קשיחות המוביל ^9, עקמומיות ^{20, 20} ו - כוח פגיעה, כמו גם גורמים ביוכימיים, כגון מאפננים של microenvironment cytoskeleton ואת הקרום שבו מולקולות אינטראקציה מתגוררים וארגון פני השטח של המולקולות הללו ^15,17,19.

השיטה גם שימש to המחקר מחייב במקביל של קולטן ליגנד מינים כפול ^3,4, ואת האינטראקציות trimolecular ¹⁹ באמצעות מודל שונה ^21.

היתרון העיקרי של השיטה הוא שהיא מאפשרת מחקר של קולטני בסביבת קרום האם שלהם. התוצאות יכול להיות מאוד שונים מאלו שהושגו באמצעות קולטנים מטוהרים ^17. זה גם מאפשר לימוד של קולטן ליגנד אינטראקציות זמנים המשנה השני עם רזולוציה הזמני הרבה מעבר שיטות ביוכימיות טיפוסיות.

כדי להמחיש את שיטת הדבקה micropipette תדר, אנו מראים מדידה קינטיקה של מולקולת הדבקה אינטר 1 (ICAM-1) על פונקציונליות RBCs מחייב β integrin _L α ₂ על נויטרופילים עם dimeric E-selectin בפתרון להפעיל α β _{L 2.}

Protocol

1. RBCs בידוד מהדם כולו

1. הכן EAS-45 פתרונות. לשקול את כל המרכיבים של טבלה ואני להמיס 100-200 מ"ל מים DI. מוסיפים מים כדי להפוך פתרון 1000ml ולהתאים את ה-pH 8.0. סינון aliquot על ידי 50 מ"ל. הקפאה ב -20 מעלות צלזיוס לאחסון.

הערה: שלב 1.2 צריכה להתבצע על ידי הכשרה מקצועית כגון רפואי כאחות, עם ראשי סקירה מוסדיים פרוטוקול שאושר.

2. צייר 3-5 מ"ל של דם מהעורק cubital החציוני לתוך צינור המכיל 10 מ"ל EDTA בעדינות לערבב את הדם עם EDTA מיידי ויסודי כדי למנוע קרישת.
3. תהליך דגימת דם בהקדם האפשרי. כל הצעדים הבאים, פרט צנטריפוגה צריך להיעשות מתחת למכסה המנוע כדי לשמור על הכנת סטרילית. מעבירים את הדם אל שפופרת 50 מ"ל צנטריפוגה, להוסיף 10 מ"ל של Histopaque קר ועקר 1077 ו צנטריפוגות עבור 5min @ 1000rpm, 4 ° C. חזור פעמיים.
4. הוסף 10מ"ל קר סטרילי PBS, צנטריפוגה עבור 5min @ 1000rpm, 4 ° C. הסר את supernatant. חזור 4 פעמים (סה"כ 5 פעמים).
5. לשטוף עם סטרילית EAS-45 (5min @ 1000rpm, 4 ° C) פעמיים. במהלך האחרון RBCs לעבור כביסה לתוך הצינור החדש 15 מ"ל סטרילי.
6. Resuspend RBCs in10ml EAS-45.

2. RBCs biotinylation

1. קחו את הצינור עם RBCs משלב 1. הסר את כל supernatant לאחר centrifuging עבור 5min @ 1000rpm, 4 ° C. שים 10μl של RBCs גלולה לכל אחד כמה צלוחיות ולהוסיף סכום המקביל ל PBS בקבוקון אחד (ר 'טבלה II למשל הכנה של שישה ריכוזים שונים RBCs biotinylation).
2. בצע טרי Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 דילולים על פי טבלה II.
3. הוסף 10μl של חיץ borate 0.1M על כל בקבוקון.
4. הוספת כמות מחושבת של פתרון ביוטין כדי בקבוקון אחד (ר 'טבלה II כדוגמה) ו מערבולת מיד.
5. המקום כל בקבוקון RBCבתוך שפופרת 50 מ"ל חרוטי ו לדגור על הכתף במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
6. שטפו כל בקבוקון 3 פעמים עם 800μl של EAS-45 עבור 2min @ 2000rpm.
7. הוסף 100μl של EAS-45 כדי בקבוקון כל החנות ב 4 ° C. ב 1μl כל הפתרון הסופי עכשיו צריך להיות ~ 1mln של RBCs.

3. Functionalizing * ביוטין צמודות ligands על RBCs

1. הכן פתרון 2mg/ml streptavidin בהתאם להוראות היצרן. פתרון Aliqouted עשוי להיות מאוחסן ב -20 ° C.
2. לערבב כמות שווה של RBCs משלב 2.7 (10μl) עם פתרון streptavidin, מערבולת מיד לדגור על הכתף במשך 30 דקות ב 4 ° C.
3. לשטוף 3 פעמים עם 500μl של EAS-45 עבור 2min @ 2000rpm. הוסף 15μl EAS-45 / 1 BSA% לאחסון.
4. לערבב כמות שווה של RBCs משלב 3.3 (10μl) עם פתרון ליגנד מערבולת 20μg/ml, מיד לדגור על הכתף במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
5. שטפו פעמיים עם 500μl של EAS-BSA 45 / 1% עבור 2min @ 2000rpm. הוסף 15μl של BSA EAS-45 / 1% לאחסון.

* אם החלבון שלך אין קישור ביוטין אתה יכול להשתמש באחד ערכות זמינים מסחרית עבור biotinylation חלבון (לדוגמא, Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro-NHS PEG4-Biotinylation Kit) או להשתמש נוגדנים לכידת biotinylated כצעד ביניים, כפי שמוצג בסרטון.

4. כימות צפיפות הקולטן ליגנד

1. דגירה ליגנד מצופה RBCs משלב 3 ו, שונה, בקבוקון קולטן נושאות תאים עם ריכוזים להרוות של מבז בהתאמה עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר. דגירה בתאים נפרדים צלוחיות עם אלוטיפ בהתאמה נוגדנים רלוונטי עבור שליטה. אם נוגדנים העיקרית אינם שכותרתו fluorescently, דגירה עם נוגדנים משני fluorescently-מצומדות בהתאם להוראות היצרן.
2. ניתוח דגימות מוכן בשלב 4.1 ידי cytometery לזרום עם המקביל פלורסנט calibration חרוזים. חשב את צפיפות כפי שמוצג באיור. 1.

5. הכנה micropipette קאמרית תא

1. משוך micropipettes משפופרות נימי באמצעות PN-30 microelectrode מגנטי "Narishige פולר זכוכית אופקי או סאטר מכשירים micropipette פולר.
2. השתמש micromanipulator עם microforge להתאים את קצה micropipette משך לגודל הרצוי (בדרך כלל בקוטר הנדרש נע בין 1-5μm בהתאם לגודל של התאים לשמש במחקר).
3. הכינו את חדר התא על ידי חיתוך כיסוי זכוכית מיקרוסקופ לגודל הרצוי. חותם את החדר באמצעות שמן מינרלי משני הצדדים כדי למנוע אידוי בינוני לשנות את osmolarity במהלך הניסוי.
4. הוסף את התאים קולטן ו ליגנד נושאות לחדר.

6. תדירות micropipette הידבקות assay

1. לשאוב את התאים על ידי אינטראקציה pipettes בהתאמה להשתמש במחשב מתוכנתים piezoelectr מתרגם IC לכונן RBC פנימה והחוצה של מגע עם התא השני עם שטח מגע זמן מבוקר. זיהוי אירועים הידבקות על ידי התבוננות התארכות RBC על ההפרדה התא.
2. חזור על מחזור מגע-נסיגת 5-10 פעמים במשך זמן קשר נתון. שיא אירועי הידבקות נצפתה על ידי הוספת "1" עבור הידבקות או "0" עבור הידבקות לא בטור של הגיליון האלקטרוני Excel. ניתן להשתמש במכשיר הקלטה, למשל, מדיה דיגיטלית או וידיאו, על תמונות מיקרוסקופיות.
3. הקלט את תדירות ההידבקות לעומת הזמן לפנות באמצעות עקומת לפחות שלושה זוגות תאים שונים עבור כל פעם לפנות לקבל מתכוון SEM.
4. הקלט את עקומת מחייב ספציפי על השליטה באמצעות RBCs מצופה ligands רלוונטי (למשל BSA) ו / או חסימת הקולטנים ligands או באמצעות מבז הספציפיים שלהם המצור תפקודית. תדירות הדבקה ספציפיות בכל נקודת זמן קשר ניתן לחשב על ידי הסרת תדירות הדבקה ספציפי ^1.

ove_title "> 7. ניתוח נתונים

1. התאם את תדירות הדבקה ספציפיות P לעומת הזמן לפנות לא נתונים על ידי מודל הסתברותי (משוואה 1) המתאר את סדר השנייה קדימה מסדר ראשון, להפוך בשלב יחיד האינטראקציה בין מין אחד של קולטנים זן יחיד של ligands ¹ :
   
   היכן K היא זיקה 2D מחייב יעיל, _את k הוא מחוץ שיעור, מ _r ו-m _l הם הקולטן בהתאמה וצפיפות ליגנד נמדד בשלב 4, _ו-c הוא שטח המגע. עקומת להתאמה יש שני פרמטרים, K _c ו - k _מעל, כמו _C ו-K הם מגובבים יחדיו וקרא קולקטיבי זיקה 2D יעיל. המוצרים שלה עם קצב-off הוא יעיל ב-2D קצב: _c = k _על k _ג K x _משם.
   תדר ספציפי הידבקות P מחושב על ידי חיסור של שבר את הידבקות ספציפי (P _{ספציפי)} של הידבקות הנמדד הכולל (P _נמדד) ^1,21:
   

8. נציג תוצאות:

איור 1 קביעת β integrin _L α ₂ צפיפות באתר נויטרופילים. נויטרופילים הודגרו הראשון עם 1μg/ml של E-selectin-איג עבור 10min כדי להתאים את תנאי הניסוי השתמשו במספרים 3,4 או בלי E-selectin-איג, ולאחר מכן עם ריכוזים להרוות (10μg/ml) נגד PE-מצומדות אנושי CD11a מב (Clone HI111, ראו טבלה של ספציפיריאגנטים וציוד) או IgG1 עכבר רלוונטית שליטה, שטף, וניתח באופן מיידי. דוגמאות נקראו על cytometer LSR לזרום עם תקן BD חרוזים QuantiBRITE PE כיול. לוח מופעים היסטוגרמות הקרינה של חרוזים כיול (ורוד) יחד עם אלו של E-selectin-איג תאים שטופלו (צבע כחול) או מטופל (צבע ירוק). ספציפית מכתים CD11a MAB מוצג עקומות מוצק נוגדן רלוונטי אלוטיפ בהתאמה מכתים לשלוט מוצג עקומות מנוקד. תאים שטופלו ב-E-selectin איג (נוכחות בכל הצעדים כביסה במאגר FACS) לא השפיע על צפיפות CD11a כפי שנראה מן ההשוואה עם בתאים שלא טופלו. לוח ב 'מראה את תהליך כימות צפיפות. LOG10 חושבה על עוצמת פלורסנט אומר (FI) של כל ערך לשיא של ארבעה היסטוגרמות כיול חרוז מלוח (עיגולים ורוד) ובמשך הרבה מולקולות ספציפיות PE לכל חרוז (מהיצרן). רגרסיה ליניארית של LOG10 מולקולות PE לכל חרוז נגד LOG10 fluorescence היה זממו. עבור E-selectin תאים התייחסו FI LOG10 (y) ערכים שווים 3.99 (עיגול כחול מוצק) ו 2.23 (מעגל פתוח כחול) עבור MAB נוגדנים ספציפיים שליטה, respectivly. אנו לפתור את המשוואה עבור x ליניארי (הערכים הם זממו כעיגולים ירוק וכחול על לוח B) x = LOG10 PE / התא, כמו PE:. יחס MAB היה 01:01, המספר הכולל של β α _{L 2} על נויטרופילים היה מחושב 9587. צפיפות פני השטח היה מחושב להיות 43 מולקולות / ² מיקרומטר, באמצעות 8.4μm כפי בקוטר ²² נויטרופילים. צפיפות של ICAM-1 נמדד באופן דומה על ידי cytometery זרימה באמצעות PE-אנטי אנושי CD54 MAB, אשר שווה 65 mol / ² מיקרומטר.

איור 2 micropipette שרטוטים המערכת. מערכת micropipette שלנו התאספו הבית מורכב משלושה תת: המשנה הדמיה כדי לאפשר אחת להתבונן, record ולנתח תנועות של התא micropipette-aspirated; המשנה המיקרומניפולציה לאפשר אחד בחר את התאים מתא לתא, לבין המשנה הלחץ כדי לאפשר אחד לשאוב את התאים לתוך micropipettes. היצירה המרכזית של המשנה הדמיה היא הפוכה מיקרוסקופ (אולימפוס IMT-2 IMT2) עם מטרה 100x טבילה שמן NA 1.25. התמונה נשלחת טייפ קלטת וידאו באמצעות מכשיר חיוב בני הזוג (CCD) המצלמה. טיימר וידאו מצמידים למערכת כדי לעקוב אחר פעם. כל micropipette ניתן להשפיע על ידי כונן מכני רכוב על המיקרוסקופ וממוקמים היטב עם micromanipulator שלוש ציר הידראולי. המניפולטורים מכונות מניופורט יכול לשמש גם כן. אחד מבעלי micropipette הוא רכוב על מתרגם פיזואלקטריים, הנהג של שבשליטת LabVIEW קוד מחשב (זמין על פי דרישה) ואת מתרגמת אותות דרך לוח DAQ דרך מגבר מתח (תוצרת בית) ל מפעיל piezo. זהllows אחד כדי להעביר את פיפטה במדויק repeatably במחזור בדיקת הידבקות. המשנה הסדרת הלחץ משמש לשליטה יניקה במהלך הניסוי. קו מחבר הידראולי בעל micropipette למאגר נוזלים. Positioner מכני מצוין מאפשר את הגובה של המאגר כדי לטפל בדיוק.

Micropipettes נוצרות באמצעות נקודת התכה KIMAX בורוסיליקט צינורות זכוכית נימי (בקוטר החיצוני של 1.0 ± 0.07 מ"מ קוטר פנימי של 0.7 ± 0.07 מ"מ. ראשית, micropipettes משפופרות נימי נמשכים באמצעות PN-30 microelectrode מגנטי "Narishige פולר זכוכית אופקי (סאטר מכשירים micropipette פולר הוא עוד אפשרות חולץ). מערכת שנית, Microforge (נבנה בבית) משמש כדי לחתוך את micropipettes לפתיחת הגודל הרצוי. הדגמים מסחרי של מערכות Microforge זמינים גם כן.

כדי למנוע רעידות של micropipettes במהלך הניסוי, microscאופ, יחד עם micromanipulators, הוא הניח על השולחן מתלי אוויר.

איור 3 הפעלת תדר F הידבקות _i עבור ספציפי (א) ולא ספציפי (ב) מחייב את 1s (אדום) 10s (כחול) פעמים חוזרות ונשנות של הקשר נמדדת במבחן מחזורי הדבקה בין RBCs מצופה ICAM-1 (א) או hIgG (B ) עם נויטרופילים אדם להביע integrin α β _{L 2. i} = F (X ₁ + X ₂ + ... + X _i) / i (1 ≤ i ≤ n), כאשר אני הוא המדד מחזור הבדיקה, X _אני שווה "1" (הדבקה) או "0" (לא הדבקה). F _n (n = 50) שימש האומדן הטוב ביותר עבור הסתברות הדבקה.

איור 4 קינטיקה שלICAM-1 מחייב β נויטרופילים integrin _L α ₂ ( ). הסתברות הדבקה נמדד כפי שמוצג באיור 3 עבור שלושה זוגות התא בזמן כל קשר הוא בממוצע ו זממו לעומת זמן מגע. החדר היה בינוני עם HBSS 1mm כל Ca ^{2 +} ו - Mg ^{2 +} פלוס 1μg/ml של dimeric E-selectin-איג אל upregulate β α _{L 2} מחייב. כדי ללכוד ICAM-1-איג על RBCs, צעד ביניים נוסף דגירה RBCs עם נוגדן ללכוד 10μg/ml (biotinylated עזים אנטי אנושי נוגדנים Fc, eBioscience) לאחר שלב הדגירה streptavidin. כדי לשלוט על ספציפי שני תנאים מחייבים שונים שימשו: 1) RBCs מצופה נוגדן אנטי אנושי Fc ללכוד מודגרות עם לנוגדנים אנושיים במקום ICAM-1-איג (O) ו 2) נויטרופילים מחייב RBCs לא מצופה ללכוד נוגדנים (Δ). 10μg/ml לנוגדנים אנושיים נוספה המדיום כדי למזער את הכריכה של ה-Selectin-איג בתמיסה כדי ללכוד הנוגדן על פני השטח RBC. מחייב ספציפי כפי שנרשמו עקומת האדם לשלוט IgG שימש לקבל עקומת הסתברות הדבקה ספציפיות ( ) באמצעות Eq. 2. התאמת ההסתברות ספציפי הדבקה עקומה עם Eq. 1 (קו מוצק) חזר זיקה מחייבת יעיל K _c = 1.4 • 10 μm4 ^-4 ו k _את = 0.3 s ^-1.

מגיב	MW (g / mol)	ריכוז (מ"מ)	סכום (ז)
אדנין	135.13	2	0.27
D-גלוקוז (דקסטרוז)	180.16	110	19.82
D-Mannitol	182.17	55	10.02
נתרן כלוריד (NaCl)	58.44	50	2.92
פוספט נתרן, Dibasic (Na HPO )	141.95	20	2.84
L-גלוטמין	146.15	10	1.46

1. טבלת הכנה EAS-45 חיץ (1 ליטר).

25 מ"ג ביוטין-XHS ב 550 μl של DMF	0.1M פתרון ביוטין
דילול 1:10 של ביוטין 0.1 W / DMF	0.01M פתרון ביוטין
1:100 דילול של ביוטין 0.1 W / DMF	0.001M פתרון ביוטין

טבלה 2. הכנת הפתרון ביוטין.

ביוטין הריכוז הסופי (מיקרומטר)	4	10	20	50	100	160
RBCs גלולה מניות (μl)	10	10	10	10	10	10
1x PBS (μl)	179.2	178	176	179	178	176.8
0.1M borate חיץ (μl)	10	10	10	10	10	10
0.01M ביוטין פתרון (μl)				1	2	3.2
0.001M ביוטין פתרון (μl)	0.8	2	4

לוח 3. Biotinylation של RBCs.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כדי להשתמש בהצלחה את הידבקות micropipette תדירות assay אחד צריך לשקול צעדים קריטיים מספר. ראשית, ודא כדי להקליט את האינטראקציה ספציפי למערכת קולטן ליגנד של עניין. מדידות בקרה ספציפי (ראה איור. 3, 4) להבטיח את הספציפיות. באופן אידיאלי, הסתברויות הדבקה ספציפי צריך להיות מתחת 0.05 עב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	קטלוג #	תגובות
10x PBS	BioWhittaker	17-517Q	מדולל עם מים כדי 1x deionized לפני השימוש
Vacutainer EDTA	BD	366643	RBCs בידוד
10 מ"ל PK100
Histopaque 1077	Sigma-Aldrich	10771	RBCs בידוד
אדנין	Sigma-Aldrich	A2786	EAS-45 הכנה
D-גלוקוז (דקסטרוז)	Sigma-Aldrich	G7528	EAS-45 הכנה
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	6360	EAS-45 הכנה
נתרן כלוריד (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	EAS-45 הכנה
פוספט נתרן, Dibasic (Na & # x2082; HPO ₄)	פישר סיינטיפיק	S374	EAS-45 הכנה
L-גלוטמין	Sigma-Aldrich	G5763	EAS-45 הכנה
ביוטין-X-NHS	Calbiochem	203188	RBCs biotinylation
Dimethylformamide (DMF)	Thermo Scientific	20673	RBCs biotinylation
Borate חוצץ (0.1M)	מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים	11455-90	RBCs biotinylation
Streptavidin	Thermo Scientific	21125	ליגנד functionalizing
BSA	Sigma-Aldrich	A0336	ליגנד functionalizing
Quantibrite PE חרוזים	BD Biosciences	340495	צפיפות כימות
תזרים cytometer	BD Immunocytometry מערכות	BD LSR II	צפיפות קוואןtification
נימי Tube 0.7-1.0mm x 30 "	קימבל זכוכית בע"מ	46485-1	Micropipette משיכת
שמן מינרלי	פישר סיינטיפיק	BP2629-1	לשכת הרכבה
כיסוי זכוכית מיקרוסקופ	פישר סיינטיפיק	12-544-G	לשכת הרכבה
Α-PE אדם CD11a Clone HI 111	eBioscience	12-0119-71	מגיב על תמונה 1
PE אנטי אנושי CD54	eBioscience	12-0549	מגיב על תמונה 1
עכבר IgG1 אלוטיפ בקרה PE	eBioscience	12-4714	מגיב על תמונה 1
הידראולי micromanipulator	Narishige	MO-303	Micropipette מערכת
מכונות מניפולטור	ניופורט	461-xyz-מ ', SM-13, DM-13	Micropipette מערכת
פיזואלקטריים המתרגם	פיזיק Instrumente	P-840	Micropipette מערכת
LabVIEW	National Instruments	גרסה 8.6	Micropipette מערכת
לוח DAQ	National Instruments	USB-6008	Micropipette מערכת
אופטי שולחן	קינטיקס מערכות	5200 Series	Micropipette מערכת