一个从人体细胞分泌蛋白生产的方便，一般的表达平台

摘要

在人类后基因组时代，在本机构的重组蛋白的结构，功能和治疗的研究和发展是至关重要的。在这里，我们描述了测试和大规模的蛋白质在人类胚胎肾细​​胞293T，可用于生产各种重组蛋白表达系统。

摘要

重组蛋白在细菌中表达，通常大肠杆菌大肠杆菌 ，一直毫克的蛋白质数量表达的最成功的战略。然而，原核主机通常是不为人类，病毒或真核蛋白质由于外国高分子毒性，在蛋白质折叠机制的差异，或因缺乏特别合作或翻译后的修改，在细菌的适当表达。基于酵母（ 毕赤酵母或酵母 ^）1,2，杆状病毒感染的昆虫（S.秋行军虫或 T 妮 ）细胞^3，和无细胞体外翻译系统的表达系统^2,4已被成功地用于生产哺乳动物蛋白质。直观，最匹配的是，使用哺乳动物的主机，以确保包含正确的翻译后修饰的重组蛋白的生产。一些哺乳动物细胞株人类胚胎小子（滋肾（HEK）293，C V-1细胞在 O rigin携带的 S V40 larget T抗原（COS）中国仓鼠卵巢（CHO），和其他人）已成功地利用过度毫克数量的人体蛋白质数量^5-9。然而，使用哺乳动物细胞中的优势往往成本较高，专业实验室设备的需求，降低蛋白质产量，和漫长的时间发展稳定表达细胞株的反击。提高产量和生产蛋白质的速度，同时保持成本低，是许多学术和商业实验室的主要因素。

在这里，我们描述了时间和成本效益，由两部分组成，附着HEK 293T细胞分泌的人类蛋白质表达过程。这个系统是能够生产微克到毫克数量的功能蛋白质结构，生物物理和生物化学研究。第一部分，是产生多个感兴趣的基因结构并行和瞬时转成小规模的附着的HEK 293T细胞。重组蛋白分泌到细胞培养液中的检测和分析，进行印迹分析，使用市售的抗体对矢量编码的蛋白质纯化标签指示。随后，适合大规模蛋白质生产结构瞬时转染使用聚乙烯亚胺（PEI）在10层的细胞工厂。成升体积的条件培养基中分泌蛋白集中到管理大量使用切向流过滤，净化，抗HA的亲和层析。这个平台的效用证明毫克量的细胞因子，细胞因子受体，细胞表面的受体，内在的制约因素，与病毒糖蛋白的表达能力。这种方法也被成功地用于三聚ebolavirus糖^5,10结构的决心。

培养箱 ，是必需的。这个过程可能会迅速扩大到更复杂的系统，如蛋白质复合物，抗原和抗体，疫苗生产的病毒样颗粒，或生产困难的细胞株转导的腺病毒或慢病毒表达。

研究方案

1。准备工作 - 构造和细胞培养

在开始的协议之前，应该感兴趣的基因密码子优化，在哺乳动物细胞中表达，并克隆到一个合适的表达载体，利用标准的分子生物学技术。为了确保最高的成功表达的机会，应产生多个感兴趣的基因变种。许多哺乳动物表达载体可商业化，并有各种净化标签（多聚组氨酸，血凝素，链，晕标签，谷胱甘肽S-转移，等等）。我们更倾向于使用pDISPLAY载体，强大的人类巨细胞病毒启动子，免疫球蛋白κ分泌信号，血凝素纯化标签编码，并拥有C-末端的跨膜锚定目标蛋白通过细胞膜上显示的分泌途径。我们通常插入一个终止密码子在前面的向量编码的跨膜安乔r以使蛋白质分泌到条件培养基。

人胚肾293T细胞（HEK）被广泛使用，容易培养和转染。的HEK 293T通常用于哺乳动物蛋白的表达，但被认为是生物危害性，并应在生物安全2级处理。请穿着适当的个人防护服装;工作应在批准的生物安全柜使用无菌技术进行。根据体制和政府的方针，所有废物和表面应进行消毒处理。据建议，细胞被支原体污染，在使用前进行测试。细胞可被视为与环丙沙星（10微克/毫升）为10天，以消除任何支原体菌源。污染。 传播HEK 293T细胞的总协议单独列示（1盒）。

测试和大规模蛋白表达的其他注意事项reviewe在^11-15。

2。小规模试验的表达

一旦结构已经设计和产生的，小规模的试验转染HEK 293T细胞进行总结的过程示意图如下（ 图1）。

1. 使用的T75 ²厘米或T225 ²厘米的细胞培养瓶（取决于进行测试表达式）增长HEK 293T细胞分裂的细胞时，细胞是100％的融合（1盒 ）每2-3天。
2. 种子2.5×10 ⁵的HEK 293T细胞在6孔板，每孔与1X笔/链球菌和10％（V / V）2毫升培养液添加胎牛血清，旋流板轻轻地，以确保每口井，即使在细胞扩散， 5％的CO ₂湿盒中孵育37℃过夜。
3. HEK 293T细胞达到40％汇合时，丢弃的媒体与的1X笔/链球菌和10％（V / V）添加淡水2毫升培养液，胎牛血清的井。演出转染实验。
4. 90μL无血清培养液分装到无菌的1.5ml离心管。吸取3μL的GeneJuice到无血清DMEM，轻轻地混合管（手指涡）。在室温下孵育5分钟。
5. 新增1微克小量纯化的质粒DNA（DNA的股票= 100毫微克/微升）为DMEM-GeneJuice混合物，手指漩涡，孵育15分钟，在室温下。
6. 吸取到HEK 293T细胞转染混合物滴加，漩涡6孔板轻轻地甚至允许转染混合物的分布。在37°C，5％的CO ₂湿盒中孵育6孔板。
7. 加入1毫升1X笔/链球菌新鲜培养液和10％（V / V）FBS每口井的24小时内转染后48小时的孵育（共72小时）。
8. 收获1毫升上清从每口井在3天转染和离心10分钟，在室温下16000克样本。开展WES燕鸥在专栏2详细blot分析。样品可以储存在4°C存储长度为4°C的蛋白依赖。

3。大规模试验的表达和纯化

一旦结构已被确定毫克数量表达重组蛋白实现裴粘附使用10层的细胞工厂（ 图2;6360厘米²表面积）HEK 293T细胞转染的。对于更多的探索性研究，小细胞工厂或T-瓶（ 见表1）可以使用。

1. 净化转，使用MaxiPrep质粒纯化试剂盒1毫克的DNA。 XL-1蓝细胞500毫升过夜培养，应该至少产生1毫克的纯DNA。检查DNA的纯度，通过测量A ₂₆₀ / A ₂₈₀比值应为1.8以上。
2. HEK 293T细胞扩展到2.0×10 ^8个细胞。每个T225厘米²瓶增长到100％汇合合作ntains和〜2.25×10 ⁷细胞的平均。
3. 新增1.2升5％（V / V）FBS DMEM培养液到10层的电池厂。加入2.0×10 ⁸ HEK 293T细胞的细胞工厂和细胞均匀地分布到所有的船只层。这是非常困难的，可视化的细胞在细胞工厂的汇合。作为替代方案，设立适当数量的细胞1的T75厘米²瓶，使用相同的细胞数量，面积比为10层的船只进行。监测这一增长率瓶。参见处理电池厂指令相关视频。与5％CO ₂孵育过夜，使细胞附着和生长，在37°C。
4. 附着HEK 293T细胞70％汇合时，执行大规模的转染。在生物安全柜使用无菌的T75厘米²瓶，准备的PEI-DNA转染混合物（3:1 W / W裴DNA比例）。 0.84毫克的DNA，用84毫升无菌1×PBS混合，再加入2.5毫升的PEI（2。5毫克总裴）。在室温下孵育15分钟。解决方案应该变得浑浊。
5. 进入细胞工厂的PEI-DNA转染混合物慢慢倒入和彻底分发到所有的船只层。可选：为表达增加产量，增加丙戊酸（终浓度为4毫米）。在37°C孵育5％的CO ₂四天。
6. 收获上清转染4天。离心30分钟空调媒体4日在6000×Ğ°C。进一步筛选上清使用0.22微米Stericup的真空过滤装置。可重复使用10层的细胞工厂，清洁指示框3。这是关键，上清收获后，立即启动清洁，不要让容器表面上的干细胞。
7. 集中上清至75毫升，使用Centramate切向流过滤系统。
8. 加入500毫升的PBS，再浓缩至75毫升。重复3 addit样品的成分，完全缓冲交换。
9. 平衡与1×PBS 1毫升抗HA的亲和层析柱和浓缩样品申请由重力流率<1毫升/分钟。
10. 30毫升的1X PBS-Tween20清洗之列。
11. 解散医管局肽在1X PBS（1.0毫克/毫升），并于37°C。
12. 适用于1毫升医管局肽的抗HA列，并允许肽流入树脂。收集的流量通过。停止流通肽的解决方案时达到床的高度。
13. 在37°C孵育15分钟，整个抗HA列。
14. 重复步骤12两个额外的时间。
15. 1毫升的1X PBS适用于抗HA列和流入树脂床，直到它到达的高度。收集的流量通过。
16. 再生与10毫升0.1 M的甘氨酸pH值2.2的抗HA列。在4°C的0.02％（W / V）在PBS南₃ 10毫升PBS和存储亲和层析柱洗净。
17. 进行SDS-PAGE分析和游泳池的Fractions相应。注：医管局肽与蛋白质浓度测量干涉一个₂₈₀或布拉德福德。要估计到SDS-PAGE胶蛋白目前，负载5，10，15，25微克的BSA作为标准和比较带强度。

可重复步骤9-17捕捉附加条件培养基蛋白。

4。代表结果

在这篇文章中，我们描述和展示毫克，随后可以使用结构和功能研究人类蛋白质的生产数量为方便表达平台。人类蛋白的筛选构建HEK 293T细胞在6孔板的使用效率和有效地确定适合较大规模的生产结构。商业的表达载体可以有效地转染的HEK 293T使用各种转染试剂的细胞，如GeneJuice，FuGene HD或PE，我们建议商业转染试剂的使用，如GeneJuice或FuGene HD，用于测试表达式，这些试剂是穷表达的蛋白（ 图3）更有效。较大规模的表达选择结构的特点应当由一个单一的，强度强带，相应的印迹（ 图3）适当的分子量。糖蛋白，可作为一个更广泛的频段，由于糖基化的异质性迁移。我们已经证明，各种大分子，从病毒的糖蛋白，细胞因子，细胞因子受体，与其他表面蛋白，可以表达和纯化产生的蛋白质的millgram数量使用这种一般的表达平台（ 图4）。

图1。小规模转染的流程示意图 。tp_upload/4041/4041fig1large.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。

图2。康宁10层为较大规模的蛋白表达CellSTACK。每一层都包含636厘米²细胞附着的表面积。一个标准的实验室_二氧化碳培养箱（6.0立方英尺）将舒适地容纳4个10层的细胞工厂。

图3小规模的各种分泌蛋白的表达，我们进行了一系列小规模的测试使用常见的转染试剂的表达：GeneJuice，FuGene HD和爱德华王子岛（一）选定的人类细胞蛋白质的免疫印迹筛选（tetherin），受体。 （IL-2受体的β亚基）和细胞因子（IL-2）。 tetherin是人类的限制释放的膜糖蛋白新生的HIV-1病毒颗粒^16。作为糖化，二硫键相连的二聚体〜36 kDa的存在的tetherin外域。还原条件下，如下所示，tetherin迁移作为一个单体〜22 kDa的表观分子量。白细胞介素-2（IL-2）是一种细胞因子（〜17 kDa的）参与淋巴细胞增殖^17。它与IL-2受体复杂交互，其中IL-2Rβsubunit（〜26 kDa的）是一个组件^18。 CD21的参与补体系统的激活和成熟B细胞是一种膜蛋白，也是EB病毒的受体。糖化CD21的细胞外域迁移作为一个单体〜20 kDa的表观分子量。（二）西方选择表面（XMRV的环境保护和ebolavirus GP）病毒糖蛋白印迹筛选。 XMRV和ebolavirus糖蛋白（跨膜锚删除）三聚尖峰存在于病毒膜，并在参与宿主细胞附着和融合。 XMRV的环境保护和EBOV GP的胞外大量的装饰与N-连接聚糖和迁移的表观分子量为70 kDa和75 kDa的分别。

图4。人体细胞蛋白质纯化大规模的HEK 293T文化 。使用的是10层的细胞工厂所有的蛋白表达，集中和抗HA色谱纯化。考马斯染色的SDS-PAGE分析表明，外域的白细胞介素-2受体（IL-2R）α和γ亚基迁移分子量为40 kDa和46 kDa的分别。的tetherin外域迁移作为一个二聚体，在非还原条件​​下，有一个明显的分子量为36 kDa的。请注意，有一个明显的分子量为60 kDa的出现，在一些BSA的污染。此外，异质性的N-连接聚糖提出tetherin扩大IL-2R的α和IL-2Rγ原因波段的SDS-PAGE凝胶上。这些复杂型N-连接聚糖肽：N-糖苷酶可以去除楼

船只	表面积
6孔板	9.5厘米2（每口井）
100 mm培养皿	55厘米2
245 mm培养皿	500厘米2
的T75厘米2瓶	75厘米2
T175厘米2瓶	175厘米2
T225厘米2瓶	225厘米2
滚瓶的定期	850厘米2
扩大表面滚瓶	1700厘米2
1层CellSTACK的	636厘米2
2层CellSTACK的	1272厘米2
5层CellSTACK的	3180厘米2
10层CellSTACK，	6360厘米2
40层CellSTACK的	25440厘米2

表1。比较细胞培养用于蛋白表达的船只。

试剂配方名单

100X环丙沙星 10毫升溶液，加入10毫升去离子水至10毫克的环丙沙星。加入10微升6N盐酸环丙沙​​星完全溶解。

PEI（1毫克/毫升）为100毫升溶液，溶解在去离子水和热量的25 kDa的线性PEI 100毫克至80°C。冷却溶液至室温，调节pH值至7.2，0.22微米过滤消毒，分装和冻结在-20°为LONÇG-长期储存。

1X PBS洗 1升水溶液：8.0 g氯化钠，氯化钾0.2克，1.4克的Na ₂ HPO _4（无水），0.24克KH ₂ PO _4。溶液的pH值调整到7.4，并填写到1.0 L。

8.0 g氯化钠，氯化钾0.2克，1.4克的Na ₂ HPO _4（无水），0.24克KH ₂ PO _4计 ，1毫升吐温20：1X 1升水溶液PBS-吐温20。溶液的pH值调整到7.4，并填写到1.0 L。

Tris碱3.0克，14.4 g甘氨酸，150毫升甲醇：1X 1升水溶液传输缓冲区 。

1X SDS-PAGE电泳运行 1升水溶液缓冲 ：3.0克Tris碱，14.4 g甘氨酸，1.0克SDS。

减少 10毫升溶液的SDS-PAGE样品缓冲液 ：0.6克SDS，1毫克溴酚蓝，1.8毫升1.0的Tris-盐酸pH值6.8，3毫升甘油，5％（V / V）2 -巯基乙醇。

框1。细胞繁殖的总协议

1. 杜尔贝科的改良Eagle在5％CO ₂饱和湿度在37°C，10％（V / V）胎牛血清（FBS）1X笔/链球菌培养基（DMEM培养基）生长在HEK 293T细胞。
2. 倒置显微镜下观察细胞。当细胞在100％汇合，删除和丢弃培养基。
3. 5毫升血清中删除的痕迹无菌的1×PBS冲洗细胞。倒掉PBS洗涤。
4. 加入2毫升0.05％（W / V）胰蛋白酶-EDTA溶液1 T225厘米²瓶（或1毫升0.05％（W / V）的T75厘米²瓶胰蛋白酶EDTA），室温孵育直到细胞分离从表面。它也有可能使用无菌1X PBS - EDTA分离​​HEK 293T细胞。
5. 10％（V / V）FBS的DMEM培养液13毫升加入1 T225厘米²瓶（或9毫升培养液，10％（V / V）胎牛血清的T75厘米²瓶），以抑制胰蛋白酶的反应。
6. 分裂ÇELLS 1:5。对于T225厘米²瓶，加入1X笔/链球菌和10％（V / V）FBS 3毫升至27毫升的新鲜培养液悬浮细胞，在一艘新的文化。为的T75厘米²瓶，加2毫升细胞悬液至8毫升的新鲜培养基。在5％CO ₂饱和湿度在37°C孵育文化。细胞应该在两天内增长到100％汇合。

专栏2。 Western blot分析

1. 加入10μL的SDS-PAGE减少样品缓冲液30μl的细胞培养上清。负载样品和预染到分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳，175 V或1小时，直到分子量标记和使用1X SDS-PAGE电泳运行缓冲electrophorese标记是很好的解决。
2. 在100％的甲醇中浸泡1分钟激活PVDF的Immobilon-P膜。
3. 组装印迹器具。确保PVDF膜面临的正极和保持湿1X传输缓冲区的所有组件。 AVO聚丙烯酰胺凝胶和膜之间的id气泡。
4. 完全填补1X传输缓冲区和1个小时的转移电泳室，在100 V。
5. 座1X PBS-Tween20 5％（W / V）脱脂牛奶膜，在室温下1小时或隔夜在4°C。
6. 孵化用单克隆抗体溶解于5％（W / V）脱脂牛奶室温1小时或隔夜1X PBS-Tween20（即1:1000稀释的抗HA抗体或其他适当的抗体）在4°C。
7. 10分钟，在1X PBS-Tween20洗膜。重复两个额外的时间。
8. 孵育中学单克隆抗体在室温下1小时碱性磷酸酶（1:1000稀释于5％（W / V）脱脂牛奶1X PBS-Tween20）共轭，或隔夜在4°C。
9. 10分钟，在1X PBS-Tween20洗膜。重复两个额外的时间。
10. 膜放入一个小容器，添加5毫升碱性磷酸酶substraTE（BCIP / NBT）的解决方案。彩色的发展应在1-5分钟内发生。一旦所需的乐队强度，达到清洗，去离子水和空气干燥。颜色随着时间的推移可能会褪色;电子扫描一次干的膜。

专栏3。清洗和回收利用细胞培养容器

虽然电池的工厂被设计为一次性使用，这些船只可以回收额外的大规模使用下列清洁协议的转染：

1. 从10层的细胞工厂的调迁上清后，立即加入20％（V / V）的漂白剂和大力摇晃来分离细胞。在室温下孵育了三个小时。
2. 清空容器，并加入新鲜的20％（V / V），漂白剂在室温下过夜孵育。
3. 清空船只，并用1.5去离子水的大号。重复三次。
4. 清空10层的细胞工厂，并添加0.5无菌1×PBS大号辅以10X抗生素/抗霉菌的解决方案。储存在室温下的船只和更换灌装之前下使用的端口（标准的33毫米螺纹帽）排气帽。注：所有层应清洗后完全清楚，如果没有，不使用和处置电池厂根据机构的指导方针。

讨论

10层的细胞工厂生产毫克的蛋白质数量的有效容器。使用超过其他传统的船只，如滚瓶，摇瓶或微调瓶，电池工厂的一个主要优点是，它们不需要任何额外的实验室设备的采购。一个标准的_二氧化碳培养箱（6.0立方英尺）轻松容纳4个10层的细胞工厂（ 图2）。此外，这些船只需要较少的劳动比菜，瓶或滚瓶细胞和蛋白质的产生和空间;一个10层的细胞工厂，相当于使用7.5定期滚?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
碱性磷酸酶（BCIP / NBT）的液体底物溶液。	西格玛	B6404
抗生素/抗霉菌，100X	Invitrogen公司	15240062
抗HA的亲和力矩阵，克隆3F10	罗氏公司	1815016
鼠单克隆抗体，抗-HA克隆16B12	Covance公司	MMS-101P
细胞培养瓶的T75厘米2组织文化对待	康宁	430641
细胞培养瓶，T225厘米2组织文化对待	康宁	431082
细胞培养板,6-以及组织培养处理	康宁	3516
电池厂，10层CellSTACK的;	康宁	3312
centramate欧米茄5K盒式	鲍尔	OS005C12
centramate欧米茄30K磁带	鲍尔	OS030C12
玻璃层析柱，1.0×10厘米	kontes	4204001010
环丙沙星	西格玛	17850
的CO 2
杜尔贝科的改良Eagle的媒体（DMEM培养基）	西格玛	D5796
胎牛血清（FBS），热灭活	Invitrogen公司	12484-028
FuGENE的HD转染试剂	Promega公司	4709691001
GeneJuice转染试剂	EMD /默克	70967-6
甘氨酸	西格玛	G8898
山羊抗鼠IgG F（AB'）2碱性	Thermo Scientific的	31324
磷酸酶抗体
血凝素（HA）肽，100毫克	金斯瑞	定制合成
（序列YPYDVPDYA纯度为95％）
HEK 293T细胞	ATCC	CRL-11268
householð漂白剂（4％W / V次氯酸钠）	各种品牌
的Immobilon - P PVDF膜	Millipore公司	IPVH07850
小量质粒纯化试剂盒，快速PureLink	Invitrogen公司	K2100-11
MaxiPrep质粒纯化试剂盒，PureLink HiPure	Invitrogen公司	K2100-07
南三	西格玛	S8032
pDISPLAY表达载体;	Invitrogen公司	V660-20
青霉素/链霉素（笔/链球菌），100X	Invitrogen公司	15140-122
磷酸盐缓冲液（PBS），无菌1X	西格玛	D8537
聚乙烯亚胺（PEI），线性25 kDa的	polyscience	23966
脱脂牛奶干粉	康乃馨
stericup-GP PES真空过滤装置，	Millipore公司	SCGPU05RE
0.22微米，500毫升容量
台盼蓝	Invitrogen公司	15250061
胰蛋白酶-EDTA，0.05％（W / V）	Invitrogen公司	25300-054
吐温20	西格玛	P7949
丙戊酸	西格玛	P4543
Centramate切向流系统	鲍尔
CO 2培养箱孵化器，标准的6.0立方米。英尺。	各种品牌
电泳和转印装置	各种品牌
孵化器，37℃	各种品牌