在OVO的HH阶段10个鸡胚Electroporations

摘要

OVO电小鸡是一种技术，这使得禽流胚胎的基因操纵。这项技术的常见应用包括基因的功能分析和公认的增强子元件。本视频演示了为HH 10鸡胚神经管电。注射技术和适当的鸡蛋处理进行了讨论。

摘要

庞大的规模和外部发展的鸡胚早已在发育生物学研究的一个有价值的工具。随着分子生物学技术的问世，小鸡已经成为一个有用的系统来研究基因表达调控和功能。通过DNA或RNA的结构到发展中国家的鸡胚电穿孔，基因表达或撞倒在体内的基因功能分析。同样，记者构造可用于映射的命运，或检查公认的基因调控元件。小鸡电相类似的实验，在小鼠，具有快捷，方便和价格低廉的优势。第一视频演示如何使一个窗口，在蛋壳操纵胚胎。下一步，胚胎是用下面的胚胎注入印度墨水的稀溶液中观察。一个玻璃针和吸管是用来注入发展中国家的神经管，铂电极平行放置胚胎，短的电脉冲脉冲发生器的管理DNA和快速的绿色染料。最后，鸡蛋是用胶带密封，并放入孵化器的进一步发展。此外，视频显示正确的鸡蛋储存和处理，并讨论可能的原因，胚胎丢失以下电。

研究方案

蛋处理

1. 鸡蛋可能保持在13 ° C，无生存能力的重大损失（是用于此目的的理想选择的一个小酒柜）一个星期前，以孵化。
2. 孵化之前，让鸡蛋温暖至室温，然后放置在加湿的鸡孵化器设置到37.8℃（100℉）。
3. 我们通常electroporate胚胎大约48小时，从孵化开始，当胚胎已达到汉堡包和汉密尔顿阶段10。
4. 根据所需的汉堡包和汉密尔顿阶段，培养时间可能会有所不同。温度是至关重要的和最佳的孵化温度偏差，将改变孵化时间，减少胚胎的可行性。
5. 鸡蛋孵化过程中，应保持在其两侧，使胚胎将被正确定位为电。胚胎会浮蛋黄上，它是有帮助的窗口前的鸡蛋的顶部用铅笔标记，让你知道在哪里削减。

制备

1. 暖莱博维茨的L - 15媒体37 ° C玻璃毛细管拉进针。位置电极和显微操纵器和连接电极的脉冲发生器。

窗口

1. 使用大口径的针头注射器，皮尔斯在壳蛋的小端。
2. 指向针仔细向下，以防止破坏蛋黄，删除有关白蛋白5毫升。
3. 密封的磁带的小片的孔。
4. 与另一片（约4 × 4厘米）的磁带封面的鸡蛋的顶部。
5. 使用弯曲的剪刀，和照顾，不破坏胚胎，切一个洞，大到足以提供一个窗口，在其中进行工作。

可选：要可视化的神经管，注入墨水的解决方案下的胚胎与26号针头（插入针下从胚胎以外的血液环）。印油墨应与汉克斯或类似的无菌缓冲溶液稀释1:5。

注射和电穿孔

1. 打破所需的直径毛细管尖，用小镊子
2. 用口吸管，装入质粒/快速的绿色染料的毛细血管。
3. 对你的头的位置胚胎和成神经管插入针浅的角度。
4. 神经管的管腔，染料，直到填满了整个空间注入质粒的解决方案。

注意：小心不要有尖较大神经管直径。在一般情况下，你就可以告诉如果已拉入毛细管液体是多么容易或硬实现最佳的针尖大小。如果有极强的抗，开放可能是太小，提示应再次被打破高。如果有很少或根本没有抵抗，开口过大，应该用一个新的针头。

1. 放置一至两滴无菌L - 15的媒体，对胚胎。
2. 立即将在10-24伏在1秒的时间间隔为50 mseconds胚胎两侧的电极，神经管平行，和脉搏的5倍。你会看到电极附近的泡沫，如果它正常工作。
3. 小心地取出电极，把胚胎上5滴的L - 15，并用胶带密封的鸡蛋。确保鸡蛋是密封良好，干燥的主要贡献者胚胎丢失，下面的电。
4. 广场蛋到孵化器，窗口的一面朝上，并孵化，直至达到所需的H＆H期。

讨论

该协议提供了一个分步指南HH10鸡胚胎神经管电。除了显示技术，还提供了存储和处理的鸡蛋准则。这种技术具有广泛的应用范围为遗传分析和实验的易用性和低成本使它们成为许多实验室是可行的。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chicken egg incubator			humidified, set to 37.80°C (100F).
Pulse generator	Genetronics	BTX T820	Square wave generator or comparable
Electrodes			our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart
Connecter cables
Micromanipulator
Dissecting scope			with large working distance
Glass capillaries			and capillary puller or commercial glass needles
Leibovitz’s L-15 media
chicken eggs			fertilized
Curved scissors
10 ml syringe
Large bore needle			16-18G
Mouth pipette
India ink
Insulin syringe/syringe
Plasmid DNA			≥ 1μg/μl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye