En Electroporations Ovo de embriones de pollo HH Etapa 10

Resumen

De pollo en la electroporación in ovo es una técnica que permite la manipulación genética del embrión aviar. Las aplicaciones más comunes de esta técnica incluyen el análisis funcional de los genes y la posible potenciador de los elementos. Este video muestra la electroporación del tubo neural en embriones de pollo HH 10. Técnica de inyección y la adecuada manipulación de los huevos se discuten.

Resumen

Gran tamaño y externa para el desarrollo del embrión de pollo desde hace mucho tiempo convertido en una herramienta valiosa en el estudio de la biología del desarrollo. Con el advenimiento de técnicas de biología molecular, la chica se ha convertido en un sistema útil para estudiar la regulación de genes y su función. Por electroporating construcciones de ADN o ARN en el embrión de pollo en desarrollo, los genes pueden expresarse o derribado con el fin de analizar la función génica in vivo. Del mismo modo, reportero construcciones se pueden utilizar para la asignación de destino o para examinar los elementos de regulación de genes putativos. En comparación con experiencias similares en el ratón, la electroporación de pollo tiene la ventaja de ser rápido, fácil y barato. Este video muestra primero cómo hacer que una ventana en la cáscara del huevo para manipular el embrión. Luego, el embrión se visualiza con una solución diluida de tinta china inyectada por debajo del embrión. Una aguja de cristal y pipetas se utilizan para inyectar el ADN y el tinte verde rápido en el tubo neural en desarrollo, a continuación, los electrodos de platino se colocan en paralelo al embrión y cortos impulsos eléctricos se administran con un generador de pulsos. Por último, el huevo está sellada con cinta adhesiva y se coloca de nuevo en una incubadora para un mayor desarrollo. Además, el video muestra el almacenamiento de huevos y manejo adecuado y se analizan las posibles causas de la electroporación de embriones después de la pérdida.

Protocolo

Manejo de huevo

1. Los huevos pueden mantenerse a 13 ° C durante hasta una semana antes de la incubación sin pérdida significativa de la viabilidad (un enfriador de vino pequeño es ideal para este propósito).
2. Antes de la incubación, los huevos permiten calentar a la temperatura ambiente, luego coloque el pollo en una incubadora humidificada conjunto a 37,8 ° C (100 ° F).
3. Por lo general, electroporar embriones de aproximadamente 48 horas desde el inicio de la incubación, cuando el embrión ha llegado a Hamburger y Hamilton etapa 10.
4. Tiempo de incubación puede variar de acuerdo a hamburguesa deseada y la etapa Hamilton. La temperatura es crítica y la desviación de la temperatura de incubación óptimo va a alterar el tiempo de incubación y la disminución de la viabilidad del embrión.
5. Durante la incubación, los huevos deben mantenerse en sus lados para que el embrión debe estar correctamente posicionado para la electroporación. El embrión flotar en la superficie de la yema y es útil para marcar la parte superior del huevo con un lápiz antes de ventanas para que usted sepa dónde cortar.

Preparación

1. Caliente Leibovitz L-15 medios de comunicación a 37 ° C. Tire de capilares de vidrio en las agujas. Electrodos posición y micromanipulador y conectar los electrodos al generador de pulsos.

Ventanas

1. Utilizando una jeringa con aguja de gran calibre, perforar la cáscara en el extremo más pequeño del huevo.
2. Apuntando la aguja hacia abajo con cuidado para evitar la interrupción de la yema de huevo, remover unos 5 ml de albúmina.
3. Selle el orificio con un pequeño trozo de cinta.
4. Cubra la parte superior del huevo con otro pedazo de cinta adhesiva (de 4x4 cm).
5. Con tijeras curvas, y teniendo cuidado de no perturbar el embrión, un agujero lo suficientemente grande como para proporcionar una ventana en la que trabajo.

Opcional: Para visualizar el tubo neural, inyectar la solución de tinta con aguja de calibre 26 debajo del embrión (insertar la aguja en el embrión desde el exterior del anillo de la sangre). Tinta china se deben diluir 1:5 con Hanks o comparable solución estéril de buffer.

Inyección y electroporación

1. Romper la punta capilar de diámetro deseado con unas pinzas
2. Use la pipeta de boca de carga del capilar con un tinte verde plásmido rápido /.
3. La posición del embrión con la cabeza hacia usted e inserte la aguja en el tubo neural en un ángulo bajo.
4. Se inyecta la solución del plásmido en el lumen del tubo neural hasta el medio de contraste llena todo el espacio.

Nota: Tenga cuidado de no tener la punta más grande que el diámetro del tubo neural. En general, usted será capaz de saber si el tamaño de la punta óptima se ha conseguido por lo fácil o difícil que es para sacar el líquido en el capilar. Si hay una resistencia extrema, la apertura es probablemente demasiado pequeño y la punta debe ser roto de nuevo más arriba. Si hay poca o ninguna resistencia, la apertura es demasiado grande y una aguja nueva debe ser utilizado.

1. Coloque una a dos gotas de agua estéril 15 L-medios de comunicación sobre el embrión.
2. Inmediatamente colocar los electrodos a ambos lados del embrión, paralela a la del tubo neural, y los tiempos de pulso de 5 a 10 a 24 voltios durante 50 milisegundos a intervalos de 1 segundo. Verá burbujas cerca de los electrodos si ha funcionado correctamente.
3. Retire con cuidado los electrodos, colocar 5 gotas de L-15 en la parte superior de los embriones y sellar el huevo con cinta adhesiva. Asegúrese de que el huevo esté bien cerrado, como el secado es un importante contribuyente a la pérdida de embriones después de la electroporación.
4. Coloque los huevos de nuevo en la incubadora, la ventana lateral, y se incuban hasta que se alcance deseado H & H etapa.

Discusión

Este protocolo proporciona una guía paso a paso a la electroporación del tubo neural de embriones de pollo HH10. Además de mostrar la técnica, las directrices para el almacenamiento y manipulación de los huevos también se proporciona. Esta técnica tiene una amplia gama de aplicaciones para el análisis genético y la facilidad y bajo costo de los experimentos los hace factible para muchos laboratorios.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chicken egg incubator			humidified, set to 37.80°C (100F).
Pulse generator	Genetronics	BTX T820	Square wave generator or comparable
Electrodes			our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart
Connecter cables
Micromanipulator
Dissecting scope			with large working distance
Glass capillaries			and capillary puller or commercial glass needles
Leibovitz’s L-15 media
chicken eggs			fertilized
Curved scissors
10 ml syringe
Large bore needle			16-18G
Mouth pipette
India ink
Insulin syringe/syringe
Plasmid DNA			≥ 1μg/μl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye