HHステージ10ニワトリ胚のOVOエレクトロポレーションで

要約

卵エレクトロポレーションのニワトリは、鳥類胚の遺伝子操作を可能にする技術です。この技法の一般的なアプリケーションは、遺伝子と推定エンハンサーエレメントの機能解析が含まれています。このビデオでは、HH 10ニワトリ胚の神経管のエレクトロポレーションを示しています。注入法と適切な卵の取り扱いが議論されています。

要約

大きいサイズとニワトリの胚の外部開発は長い間その発生生物学の研究に貴重なツールてきた。分子生物学的手法の出現で、ひよこは、遺伝子調節と機能を研究するために有用なシステムとなっています。開発ニワトリ胚へのDNAまたはRNAの構造をelectroporatingことにより、遺伝子が発現したり、in vivoでの遺伝子機能で分析するためにノックダウンすることができます。同様に、レポーターコンストラクトは、運命のマッピングに使用することができますまたは推定される遺伝子調節エレメントを調べることができます。マウスで同様の実験と比較すると、ひよこのエレクトロポレーションは、迅速、簡単かつ安価であるという利点を持っています。このビデオでは、胚を操作するために卵殻にウィンドウを作る方法を第一を示しています。次に、胚は、胚の下に注入されたインドのインクの希釈溶液で可視化です。ガラス針とピペットを開発神経管にDNAとファストグリーン色素を注入するために使用され、その後、白金電極を胚に平行に配置され、短い電気パルスは、パルス発生器で投与されています。最後に、卵をテープで密封され、さらなる発展のためにインキュベーターに戻されます。さらに、ビデオは、適切な卵の保管と取り扱いを示し、胚損失、以下のエレクトロポレーションの原因を説明します。

プロトコル

卵の取り扱い

1. 卵は生存率の大幅な損失（小さなワインクーラーは、この目的のために理想的です）のないインキュベーションの1週間前までに13 ° Cに保つことができる。
2. インキュベーターは、37.8℃（100 ° F）を設定した加湿鶏肉の代わりにし、卵は室温に戻して、インキュベーションの前に。
3. 我々は通常、胚がハンバーガーとハミルトンのステージ10に到達したインキュベーションの開始から胚を約48時間エレクトロ。
4. インキュベーションの時間は、目的のハンバーガーとハミルトンの段階に応じて異なる場合があります。温度は非常に重要であり、最適なインキュベーション温度からの偏差は、培養時間と減少の胚の生存率を変更します。
5. インキュベーションの間、卵は胚が正常にエレクトロポレーションのために配置されるように、その両側に保つ必要があります。胚は、卵黄の上に浮遊し、あなたがどこに切ることがわかっているので、それは窓の前に鉛筆で卵の上にマークを付けると便利です。

準備

1. 37℃くらいまで温めリーボビッツL - 15メディア針にガラスキャピラリーを引き出します。位置の電極とマイクロマニピュレータ及びパルス発生器に電極を接続してください。

ウィンドウイング

1. 穴を開ける卵の小さい端のシェル、大口径針で注射器を使用する。
2. 卵黄の混乱を防ぐために慎重に下に針を指す、アルブミン5mlの約取り外します。
3. テープの小片で穴を塞ぐ。
4. テープの別の部分（4 × 4 cm程度）で卵の上部をカバーしています。
5. 湾曲したハサミを用いて、胚を破壊するように注意しながら、作業のためのウィンドウを提供するために十分な大きさの穴をカット。

オプション：神経管を可視化するために、胚の下に26ゲージの針（血液の環の外からの胚の下に針を挿入する）でインク液を注入。インドのインクは、ハンクスまたは同等の滅菌緩衝液で1:5に希釈する必要があります。

注射とエレクトロポレーション

1. ピンセットを用いて所望の直径にキャピラリー先端を破る
2. 口のピペットを用いて、プラスミド/ファストグリーン色素でキャピラリーを読み込みます。
3. あなたに向かって頭に胚を置いて、浅い角度で神経管に針を挿入する。
4. 染料が全体のスペースを使い切るまで、神経管の内腔にプラスミド溶液を注入。

注：先端大きくして神経管の直径を持つように注意してください。一般的には、最適なチップサイズは、それが毛細血管に液体をプルするのがいかに簡単かとても近くに達成されたかどうかを確認することができるようになります。極端な抵抗がある場合は、開口部が小さすぎると考えられますし、先端が再び上位に分割する必要があります。ほとんど、あるいはまったく抵抗がある場合は、開口部が大きすぎると新しい針を使用する必要があります。

1. 胚の滅菌L - 15のメディアの場所は、1〜2滴。
2. すぐに1秒間隔で50 msecondsために10から24ボルトで神経管に平行胚の両側に電極、およびパルスを5回に置きます。それが正常に働いていた場合には、電極近傍の気泡が表示されます。
3. 慎重に、電極を除去胚の上にL - 15の5滴を入れ、テープで卵を密封する。乾燥は、エレクトロポレーションは、次の胚損失の主な原因であるとして、卵がよく、密封されていることを確認します。
4. 場所はバックインキュベーターに卵、ウィンドウのサイドアップ、およびそれらが所望のH＆Hのステージに到達するまでインキュベートする。

ディスカッション

このプロトコルは、HH10のニワトリ胚の神経管のエレクトロポレーションにステップバイステップガイドを提供します。手法を示すことに加えて、ストレージと卵の処理のためのガイドラインも提供されています。この手法は、遺伝学的解析のための広範囲なアプリケーションを持っており、実験の容易さと低コストは、多くのラボのためのそれらを実現可能になります。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chicken egg incubator			humidified, set to 37.80°C (100F).
Pulse generator	Genetronics	BTX T820	Square wave generator or comparable
Electrodes			our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart
Connecter cables
Micromanipulator
Dissecting scope			with large working distance
Glass capillaries			and capillary puller or commercial glass needles
Leibovitz’s L-15 media
chicken eggs			fertilized
Curved scissors
10 ml syringe
Large bore needle			16-18G
Mouth pipette
India ink
Insulin syringe/syringe
Plasmid DNA			≥ 1μg/μl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye