In Electroporations Ovo della Fase HH 10 embrioni di pollo

Riepilogo

Pulcino in ovo elettroporazione è una tecnica che permette di manipolazione genetica dell'embrione aviaria. Comuni applicazioni di questa tecnica includono l'analisi funzionale dei geni e dei putativi elementi enhancer. Questo video dimostra l'elettroporazione del tubo neurale in HH 10 embrioni di pollo. Tecnica di iniezione e la gestione corretta di uova sono discussi.

Abstract

Grandi dimensioni e sviluppo esterno dell'embrione di pollo hanno da tempo reso un prezioso strumento nello studio della biologia dello sviluppo. Con l'avvento di tecniche biologiche molecolari, il pulcino è diventato un sistema utile per studiare regolazione genica e la funzione. Da electroporating costruisce DNA o RNA in un embrione di pollo di sviluppo, i geni possono essere espressi o abbattuto al fine di analizzare in funzione del gene in vivo. Allo stesso modo, costruisce giornalista può essere utilizzato per mappare il destino o per esaminare gli elementi gene putativo regolamentazione. Rispetto a esperimenti simili nel topo, elettroporazione pulcino ha il vantaggio di essere rapida, semplice e poco costoso. Questo video dimostra come prima di fare una finestra nel guscio d'uovo di manipolare l'embrione. Quindi, l'embrione viene visualizzato con una soluzione diluita di inchiostro di china iniettato sotto l'embrione. Un ago pipetta di vetro e sono usati per iniettare il DNA e Fast colorante verde nel tubo di sviluppo neurale, poi elettrodi di platino sono posti in parallelo per l'embrione e brevi impulsi elettrici vengono somministrati con un generatore di impulsi. Infine, l'uovo è sigillato con nastro adesivo e rimesso in un incubatore per un ulteriore sviluppo. Inoltre, il video mostra la corretta conservazione delle uova e la manipolazione e discute le possibili cause di elettroporazione in seguito alla perdita degli embrioni.

Protocollo

Uovo di movimentazione

1. Le uova possono essere conservati a 13 ° C fino a una settimana prima di incubazione senza significativa perdita di vitalità (un dispositivo di raffreddamento piccolo vino è l'ideale per questo scopo).
2. Prima di incubazione, permettono uova a temperatura ambiente, quindi posto in un incubatore umidificato pollo impostato a 37,8 ° C (100 ° F).
3. Noi di solito electroporate embrioni circa 48 ore dall'inizio di incubazione, quando l'embrione ha raggiunto Hamburger e lo stadio Hamilton 10.
4. Tempo di incubazione può variare a seconda Hamburger desiderata e fase Hamilton. La temperatura è critica e deviazione dalla temperatura di incubazione ottimale sarà alterare il tempo di incubazione e di diminuire la vitalità degli embrioni.
5. Durante l'incubazione, le uova devono essere tenute nella loro lati in modo che l'embrione sarà posizionato correttamente per l'elettroporazione. L'embrione galleggia sopra il tuorlo ed è utile per marcare la cima l'uovo con una matita prima di finestre in modo da sapere dove tagliare.

Preparazione

1. Caldo Leibovitz L-15 media a 37 ° C. Tirare vetro capillari in aghi. Elettrodi di posizione e micromanipolatore e collegare gli elettrodi al generatore di impulsi.

Windowing

1. Usando una siringa con ago grande foro, perforare il guscio alla fine del piccolo uovo.
2. Che punta l'ago con attenzione verso il basso per evitare di disturbare il tuorlo, rimuovere circa 5 ml di albumina.
3. Sigillare il foro con un piccolo pezzo di nastro adesivo.
4. Coprire la parte superiore dell'uovo con un altro pezzo di nastro (circa 4x4 cm).
5. Utilizzando forbici curve, e facendo attenzione a non disturbare l'embrione, un foro appena sufficiente per fornire una finestra in cui lavorare.

Opzionale: Per visualizzare il tubo neurale, iniettare la soluzione di inchiostro con 26 gauge sotto l'embrione (inserire ago sotto l'embrione da fuori dal ring sangue). China devono essere diluiti 1:5 con soluzione di Hanks o comparabili sterile tamponata.

Iniezione e Elettroporazione

1. Rompere la punta capillare di diametro desiderato con pinzette
2. Utilizzando la pipetta bocca, caricare il capillare con plasmide / Fast colorante verde.
3. Posizionare l'embrione con la testa verso di voi e inserire l'ago nel tubo neurale con un angolo basso.
4. Iniettare la soluzione plasmide nel lume del tubo neurale fino colorante riempie l'intero spazio.

Nota: Fare attenzione a non avere più punta poi diametro del tubo neurale. In generale, si sarà in grado di dire se la dimensione ottimale punta è stata raggiunta da quanto facile o difficile è tirare liquido nel capillare. Se vi è estrema resistenza, l'apertura è probabilmente troppo piccolo e la punta dovrebbe essere rotto di nuovo più in alto. Se vi è poca o nessuna resistenza, l'apertura è troppo grande e un nuovo ago deve essere usato.

1. Mettere 1-2 gocce di sterili L-15 multimediale su l'embrione.
2. Immediatamente gli elettrodi su entrambi i lati dell'embrione, parallelamente al tubo neurale, e il polso 5 volte a 10-24 volt per 50 mseconds a intervalli di 1 secondo. Vedrete bolle in prossimità degli elettrodi se ha funzionato correttamente.
3. Rimuovere con attenzione elettrodi, mettere 5 gocce di L-15 sulla parte superiore degli embrioni e sigillare l'uovo con del nastro adesivo. Assicurarsi che l'uovo è ben sigillato, l'essiccazione è una delle principali cause di perdita dell'embrione dopo l'elettroporazione.
4. Mettere le uova di nuovo nel incubatore, finestra a lato, e incubare fino a raggiungere desiderato H & H stadio.

Discussione

Questo protocollo fornisce una guida passo-passo per elettroporazione del tubo neurale HH10 di embrioni di pollo. Oltre a mostrare la tecnica, le linee guida per lo stoccaggio e il trattamento delle uova è prevista anche. Questa tecnica ha una vasta gamma di applicazioni per l'analisi genetica e la facilità ea basso costo di esperimenti li rende fattibile per molti laboratori.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chicken egg incubator			humidified, set to 37.80°C (100F).
Pulse generator	Genetronics	BTX T820	Square wave generator or comparable
Electrodes			our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart
Connecter cables
Micromanipulator
Dissecting scope			with large working distance
Glass capillaries			and capillary puller or commercial glass needles
Leibovitz’s L-15 media
chicken eggs			fertilized
Curved scissors
10 ml syringe
Large bore needle			16-18G
Mouth pipette
India ink
Insulin syringe/syringe
Plasmid DNA			≥ 1μg/μl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye