同时细胞内记录的车组在成年小鼠的腰椎运动神经元产生的力<em在体内</em

Marin Manuel; C.J. Heckman

doi:10.3791/4312

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摘要

这种新方法允许同时细胞内记录一个单一的成年小鼠运动神经元和其肌肉纤维所产生的力的测量。合并后的调查是在正常和转基因动物的运动单位的电气和机械性能的神经肌肉系统的研究的一大突破。

摘要

脊髓运动神经元长期以来一直是良好的模型系统的研究神经功能，因为它是一种中枢神经系统的神经元与独特的性能（1）因此，具有易于识别目标的（肌纤维）和具有非常著名的功能（来控制肌肉收缩），（2）的收敛许多脊髓和下行网络的目标，故名“最后共同通路”;（3）有一个大的胞体，这使得它可以穿透它们用锋利的内电极。此外，当在体内研究，这是能够同时记录的运动神经元的电活动的和由他们的肌肉目标开发的力。因此， 在体内的运动神经元进行细胞内记录将实验者的研究中的独特地位，在同一时间，所有的隔间“机动装置”（名字的运动神经元，其轴突，和它支配的肌纤维^1）：撞击的运动神经元的输入，运动神经元的电生理特性，以及这些特性的影响的运动神经元的生理功能，即其运动单位所产生的力。然而，这种方法是非常具有挑战性的，因为该制剂不能瘫痪，从而减少细胞内记录的机械稳定性。因此，这种实验只被实现在猫和大鼠。然而，这项研究对脊髓运动系统可以使一个强大的飞跃，如果有可能进行类似的实验，在正常和转基因小鼠。

由于技术上的原因，大多是在小鼠的脊髓网络的研究仅限于新生儿在体外的准备工作，是不成熟的运动神经元和脊髓的网络，运动神经元分开，他们的目标，并研究时，莫片toneurons分离大部分来自其输入。直到最近，只有几组^2-4体内的运动神经元细胞内记录，包括我们的团队出版了一本新的准备，使我们能够获得非常稳定的运动神经元在成年小鼠体内的录音^5,6。然而，这些录音瘫痪的动物，即没有可以记录这些运动神经元的输出力。在这里，我们提出了一个延伸，这种原始的准备中，我们能够获得的运动神经元的电生理特性和开发他们的运动单位的力量的同时录制。这是一个重要的成就，因为它使我们能够识别不同类型的运动神经元的基础上的力的分布，从而揭示它们的功能。再加上遗传模型干扰脊髓节段电路^7-9，或reproducting人disea本身^10,11，我们希望这是一个必不可少的工具，为研究脊髓运动系统的技术。

研究方案

1。第一步

麻醉前用药：麻醉诱导前10-15分钟，注射阿托品（0.20毫克/千克）和皮下methylprenidsolone（0.05毫克），以防止唾液分泌和水肿，分别。

2。第二步

诱导麻醉：注入戊巴比妥钠（70毫克/千克）或它们的混合物的氯胺酮/甲苯噻嗪（100毫克/千克和10毫克/公斤，分别）腹膜内。让鼠标可以得到下，直到没有脚趾掐反射。如果麻醉似乎过轻，补充的剂量的1/4。

3。第三步

*注：这个手术是一个终端程序。

当已达到手术的麻醉，转让的鼠标上提出的温暖的被窝里，在俯卧位。

提供纯净的O ₂在100毫升/分钟绕流口罩盖住口鼻部的鼠标。
剃须右后肢。
鼠标翻转至仰卧位，但要注意离开氧气面罩。

4。第四步

代替环绕四肢和固定在工作表面的四个角用缝线固定鼠标。

5。第五步

将温度探头监控鼠标的核心温度。调整加热毯/灯功率保持核心温度在36°C和38°C之间

6。气管切开术和人工通气

使用钝头剪刀，作一个切口，气管，双方拉扯皮肤。
使用钝钳，撕开的唾液腺，使两个薄肌（胸骨舌骨），气管暴露。
使用钝钳，分开的两个MUSCLES沿其内侧分离，揭示了气管。
使用杜蒙7钳，将两个长度为4.0丝线缝合气管。
在气管中的两个软骨环之间做一个横向切割，但小心不要完全节的气管。
下来的气管，插入气管导管的插入口的两侧，然后将其固定绑在它的缝合线。气管导管连接到鼠标换气装置（SAR-830/AP，CWE公司）和一个的的二氧化碳波形（μcapstar，CWE公司）。呼吸机相连，通过合规袋，纯O ₂的来源。调整的参数呼吸机（呼吸频率100〜150 BPM，呼气末体积170-310微升），使鼠标不反对的人工通气和呼气末_二氧化碳分压是稳定的4％和5％之间。

7。静脉注射管的放置

使用钝性分离，暴露在颈一侧上的颈静脉。在这个层面上，颈内静脉分裂成两个主干，前部和后部的面部静脉。
做两次，一组为这些树干下面的步骤：
1. 通过使用，杜蒙4或5镊子，仔细分离静脉及其周围的结膜组织。
2. 经静脉使用杜蒙7钳，将两个长度为6.0丝线。尽可能地将它们分开沿长度的静脉。
3. 放置一个小的血管夹的基端侧的静脉（最接近心脏侧），和配合的前端侧的静脉。
4. 使用非常精细虹膜剪，做一个小横切口静脉，特别注意不要第静脉完全。
5. 预灌封1FR的导管（premicath，Vygon）插入在所述开口中，最多船只剪辑。
6. 保持静脉导管在杜蒙4镊子，小心地取出血管夹，然后按下的导管几个铁道部Ë毫米到静脉。
7. 通过把它与插入两侧的两个缝线固定导管。
一个导管的是，连接到注射器或注射器泵注入补充剂量的麻醉剂在必要时（通常每10-30分钟）。 IV剂量为6毫克/公斤的戊巴比妥钠或1250 40微克/公斤/分钟的氯胺酮/甲苯噻嗪^12。其他导管连接到注射泵，一个缓慢静脉输注（50微升/小时）含有的NaHCO _3（1％）和plasmion（14％）的4％葡萄糖溶液。

8。颈部皮肤针和缝线关闭，并返回鼠标俯卧位

9。后肢肌肉和神经的解剖

用剪刀，做一个切口从顶部的大腿跟腱。分开皮肤下面的肌肉，注意不要损伤血管。烧灼根据需要。
仔细解剖股二头肌。烧灼/的结扎的需要，以防止出血。股二头肌可以完全删除，或简单地倾斜，，暴露坐骨神经和小腿三头肌。
解剖出腓肠神经。
使用8/0丝线，配合腓总神经远端部分，并切结远端。解剖神经的方式，尽量靠近臀部尽可能。
确定胫神经，腓总神经和腓肠神经之间。在不同的胫骨神经分支，从树枝上，去更深（以下简称为胫神经）支配的小腿三头肌的分支机构。
8/0丝线线，绑在一起，同时保持完整的分支支配的小腿三头肌，胫骨神经的分支。切远端胫骨神经结和解剖神经尽可能。
用生理盐水，以防止熏陶使干燥而进行的下一个步骤，用纱布覆盖整个后肢。

10。椎板切除术

用剪刀沿骨干，做一个切口。分开皮肤下面的肌肉。
车型的椎骨分开皮下肌肉的每一侧上的两个切口。然后切成每个腱的肌肉附着在侧的每一侧上的椎骨。
使用钝钳和罚款刮匙，除去剩余的肌肉上的背侧的椎骨周围的棘突，清楚地识别每个单独的椎骨。
确定椎骨T13和L1。 T13是最后的脊椎肋骨附加。脊柱瓦特生病被固定使用坎宁安脊髓椎夹（Stoelting公司）。将脊髓夹具T13和L1的每一侧上。要小心，不要压迫脊髓，但在纵向轴线放一点点的紧张。检查脊柱固定好，用钳子轻轻按下。
使用细咬骨钳，取出脊髓进程，然后薄层T13和L1，从而暴露脊髓。
覆盖暴露的脊髓与少量的熏陶用生理盐水，以防止干燥的棉布或spongel。
将一个定制的塑料浴缸的背面上，周围的脊髓。在使用4/0丝线固定浴。确保浴防水密封KWIK-CAST密封胶（WPI）。
KWIK-主演干燥后，除去覆盖脊髓的棉花，填充矿物油浴。
杜蒙5钳子和非常精细虹膜剪，轻轻一拉硬脊膜入ŕ周围的脊髓，并尽可能在两个方向打开。折叠在每边的脊髓硬膜。
放下鼠标躺在上，以便保持它暂停椎钳位凸起平台。
请使用另一个椎夹具夹紧骶骨部棘突的支持后区的动物。
第三个钳位二极管是用来固定右后肢和踝关节，在以90°角在膝盖弯曲。

11。跟腱解剖

在90℃在膝盖和脚踝处的弯曲，将肢体，取出纱布覆盖后肢区域，并解剖无周围组织的跟腱。解剖尽可能多尽可能小腿三头肌，以及从周围组织。
切靠近跟骨跖肌肌腱，然后剪了一次完全删除肌腱。
使用一个螺纹针，通过第6/0丝线连接Ë跟腱和周围的肌腱，使三结。
将力传感器结，切断远端的肌腱，将其连接到力传感器使用的丝线。
将两根不锈钢线下筋膜的小腿三头肌。这些导线被连接到细胞外的AC放大器肌电记录。
两个双极型钩电极，将腓总神经和胫神经。
将小腿三头肌神经的钩电极的阴极上，与阳极接触附近的肌肉。
将刺激电极隔离病房。
放置球的脊髓背表面电极，连接到外的AC放大器记录脊髓背潜力的。放置一个Ag / AgCl参考电极接触的背面的肌肉。

12。第十二步

刺激小腿三头肌神经使用一个50微秒的方波脉冲的强度的增加在低频率（<1赫兹），直至观察到最大抽搐振幅。慢慢地移动的力换能器拉伸的肌肉，同时监测的抽搐反应的，直到抽搐振幅达到最大振幅。

13。运动神经元细胞内记录

从这个角度上，标准的电生理技术用于制备细胞内的电极，穿透脊髓神经元，将其识别为一个运动神经元。

一个玻璃微拉来了〜1微米提示，用吸管拆卸器（P-97微管牵引机，萨特仪器）。填充电极的KCl的3M溶液（电阻电极10-20MΩ）。
使用微定位器，驱动微吸管，连接到脊髓内的放大器（Axoclamp 2B，Axon Instruments公司）。监控由电子刺激引起的局部场电位ACH神经定位电机池的小腿三头肌。
监测的微电极的电阻的同时，小心地接近推定的运动神经元。当推压的膜，电阻增加。可以使用的“嗡嗡”功能的细胞内放大器的某个时候将促进渗透。

14。安乐死过程

在实验结束时，由过量的戊巴比妥钠（210毫克/千克IV）中，然后用断头动物安乐死。