Enregistrement simultané intracellulaire d&#39;un motoneurone lombaire et la force produite par l&#39;unité de moteur chez la souris adulte<em&gt; In vivo</em

Résumé

Cette nouvelle méthode permet l'enregistrement simultané intracellulaire d'une souris adulte seul motoneurone et la mesure de la force produite par les fibres musculaires. L'enquête combine des propriétés électriques et mécaniques des unités motrices chez les animaux normaux et génétiquement modifiées est une percée pour l'étude du système neuromusculaire.

Résumé

Le motoneurone spinal a longtemps été un bon modèle pour l'étude de la fonction nerveuse parce que c'est un neurone du système nerveux central avec des propriétés uniques de (1) ayant des cibles facilement identifiables (les fibres musculaires) et donc ayant une fonction bien connue (pour contrôler la contraction musculaire), (2) d'être la cible de convergence de plusieurs réseaux spinaux et descendant, d'où le nom de «voie finale commune», et (3) ayant une grande soma qui permet de les pénétrer avec de fortes électrodes intracellulaires . En outre, lorsqu'ils sont étudiés in vivo, il est possible d'enregistrer simultanément l'activité électrique des neurones moteurs et la force développée par leurs cibles musculaires. Effectuer des enregistrements intracellulaires de motoneurones in vivo donc mis l'expérimentateur dans la position unique d'être en mesure d'étudier, dans le même temps, tous les compartiments de l '"unité moteur" (le nom donné à l'motoneurone, son axone, etles fibres musculaires qu'il innerve ^1): les entrées empiétant sur ​​le motoneurone, les propriétés électrophysiologiques du motoneurone, et l'impact de ces propriétés sur la fonction physiologique des motoneurones, c'est à dire la force produite par son moteur. Cependant, cette approche est très difficile parce que la préparation ne peut pas être paralysé et donc la stabilité mécanique de l'enregistrement intracellulaire est réduite. Ainsi, ce type d'expériences a été réalisée que chez les chats et les rats. Cependant, l'étude des systèmes spinaux pourrait faire un bond formidable s'il était possible de réaliser des expériences similaires chez les souris normales ou génétiquement modifiés.

Pour des raisons techniques, l'étude des réseaux spinaux chez la souris a été principalement limitée aux nouveau-nés dans les préparations in vitro, où les motoneurones spinaux et les réseaux sont immatures, les motoneurones sont séparés de leurs objectifs, et lorsqu'ils sont étudiés en tranches, le motoneurons sont séparées de la plupart de leurs intrants. Jusqu'à récemment, seuls quelques groupes ont réussi à effectuer des enregistrements intracellulaires de motoneurones in vivo ^2-4, y compris notre équipe qui a publié une nouvelle préparation qui nous a permis d'obtenir des enregistrements très stables des motoneurones in vivo chez la souris adulte ^5,6. Toutefois, ces enregistrements ont été obtenus chez les animaux paralysés, c'est à dire sans la possibilité d'enregistrer la sortie de force de ces motoneurones. Ici, nous présentons une extension de cette préparation originale dans laquelle nous avons pu obtenir des enregistrements simultanés des propriétés électrophysiologiques des motoneurones et de la force développée par leur moteur. Il s'agit d'une réalisation importante, car elle nous permet d'identifier les différents types de motoneurones en fonction de leur profil de force, et révélant ainsi leur fonction. Couplés avec des modèles génétiques perturbant la colonne vertébrale segmentaire circuits ^7-9, ou reproducting humaine disea^10,11 soi, nous nous attendons que cette technique soit un outil essentiel pour l'étude du système moteur spinal.

Protocole

1. Première étape

Pré-anesthésique médicaments: 10-15 min avant l'induction de l'anesthésie, injecter atropine (0,20 mg / kg) et methylprenidsolone (0,05 mg) sous-cutanée pour éviter salivation, un œdème, respectivement.

2. Deuxième étape

L'induction de l'anesthésie: injection de pentobarbital sodique (70 mg / kg) ou un mélange de kétamine / xylazine (100 mg / kg et 10 mg / kg, respectivement) intra-péritonéale. Laissez la souris jusqu'à passer sous aucun réflexe pincement de l'orteil peut être obtenue. Si l'anesthésie semble trop claire, complète avec 1/4 de la dose.

3. Troisième étape

* Remarque: cette chirurgie est une procédure terminale.

Quand un plan chirurgical de l'anesthésie a été atteint, le transfert de la souris sur une couverture posée au chaud dans une position couchée.

1. Couvrir le nez de la souris avec un masque délivrant O ₂ pur à un débit d'environ 100 ml / min.
2. Utilisation d'une tondeuse à cheveux, raser la région dorsale, depuis la nuque du cou à la base de la queue.
3. Shave également la patte arrière droite.
4. Retournez la souris à la position couchée, mais prenez soin de laisser le masque à oxygène à la place.

4. Quatrième étape

Assurer la souris en place par des sutures en boucle autour des branches et fixé aux quatre coins de la surface de travail.

5. Cinquième étape

Insérer une sonde de température pour surveiller la température à coeur de la souris. Réglez couverture chauffante / puissance de la lampe pour maintenir la température centrale de 36 ° C et 38 ° C.

6. Trachéotomie et ventilation artificielle

1. Avec des ciseaux émoussés, faire une coupe au-dessus de la trachée et tirez la peau loin des deux côtés.
2. Utilisant le forceps émoussé, déchirer la glande salivaire de manière à exposer deux muscles sterno minces () couvrant la trachée.
3. Utilisant le forceps émoussé, séparer le musc deuxles le long de leur séparation médiane pour révéler la trachée.
4. En utilisant un 7 Dumont pince, faites glisser deux longueurs de 4,0 suture de soie sous la trachée.
5. Faites une coupe transversale dans la trachée entre deux anneaux cartilagineux mais prenez garde à ne pas complètement la section de la trachée.
6. Insérer le tube trachéal dans la trachée, puis la fixer sur les deux côtés de l'ouverture d'insertion en reliant les points de suture sur elle. Le tube trachéal est relié à un ventilateur de souris (SAR-830/AP, Inc CWE) et un capnographe (μcapstar, CWE Inc). Le ventilateur est relié, par l'intermédiaire d'un sac de conformité, à une source d'O ₂ pur. Réglez les paramètres du ventilateur (100-150 bpm rythme respiratoire, le volume de fin d'expiration 170-310 pi) de sorte que la souris ne se bat pas contre la ventilation artificielle et la pCO fin d'expiration ₂ est stable entre 4 et 5%.

7. Placement des lignes intraveineuses

1. En utilisant des techniques de dissection émoussés, exposer la jugulaireveine d'un côté de la nuque. A ce niveau, la veine jugulaire se divise en deux troncs principaux, les veines antérieures et postérieures du visage.
2. Effectuez les étapes suivantes deux fois, une fixés pour chacun de ces troncs:
   1. Utilisation Dumont 4 ou 5 pince, dégagez soigneusement la veine de son tissu conjonctif environnant.
   2. En utilisant une pince Dumont 7, faites glisser deux longueurs de 6,0 points de suture de soie sous la veine. les séparer autant que possible le long de la longueur de la veine.
   3. Placez un clip petit bâtiment sur le côté proximal de la veine (le côté le plus proche du cœur), et attacher le côté distal de la veine.
   4. En utilisant des ciseaux très fins iris, faire une petite incision transversale dans la veine, en prenant grand soin de ne pas la section de la veine complètement.
   5. Insérer un cathéter pré-remplie 1Fr (premicath, Vygon) dans l'ouverture, jusqu'à la pince navire.
   6. Tenir la veine et le cathéter ensemble dans un 4 Dumont pince, retirer délicatement le clip navire, puis pousser le cathéter d'un mor quelquese millimètres dans la veine.
   7. Fixer le cathéter en l'attachant avec deux fils de suture, des deux côtés de l'insertion.
3. L'un des cathéters est reliée à une seringue ou une pompe à seringue pour injecter des doses supplémentaires d'anesthésiques chaque fois que nécessaire (en général chaque min 10-30). La dose IV est soit 6 mg / kg de pentobarbital de sodium ou 1250 40 ug / kg / min de kétamine / xylazine ^12. Le cathéter autre est reliée à une pompe à seringue pour une injection intraveineuse lente (50 ul / heure) d'une solution de glucose à 4% contenant NaHCO ₃ (1%) et plasmion (14%).

8. Fermez la peau du cou avec aiguille et la suture, et le retour de la souris pour position couchée

9. Dissection du muscle Hind-membres et les nerfs

1. Avec des ciseaux, faire une incision du haut de la cuisse au tendon d'Achille. Séparer la peau des muscles sous-jacents, en prenant soin de ne pas endommager les vaisseaux sanguins. Cautériser au besoin.
2. Identifier le bord antérieur du muscle biceps crural, qui apparaît comme une ligne blanche courir dans la cuisse. Avec des ciseaux, ouvrir avec précaution le long de la ligne à partir du genou tout le chemin jusqu'à l'os de la hanche. Séparez les muscles. Le nerf sciatique est maintenant visible sous le biceps crural.
3. Disséquer soigneusement les biceps crural. Cautériser / ligature au besoin pour prévenir les saignements. Le biceps fémoral peut être totalement retirée ou simplement incliné pour exposer le nerf sciatique et les triceps sural muscles.
4. Disséquer le nerf sural.
5. Utiliser du fil de soie 8/0, ficeler la partie distale du nerf fibulaire commun et couper distale du nœud. Disséquer le nerf tout le chemin jusqu'à, au plus près de la hanche que possible.
6. Identifier le nerf tibial entre les nerfs péronier commun et Sural. Parmi les différentes branches du nerf tibial, identifier les branches qui innervent le muscle triceps sural des branches qui vont plus en profondeur (ci-après dénommé nerf tibial).
7. Utilisation 8/0 de la soiefil, relier toutes les branches du nerf tibial tout en gardant intactes les branches innervent le triceps sural. Couper le nerf tibial distal du au noeud et à disséquer le nerf aussi loin que possible.
8. Couvrir la totalité des membres postérieurs avec une gaze imbibée de sérum physiologique pour éviter le dessèchement tout en procédant à l'étape suivante.

10. Laminectomie

1. Avec des ciseaux, faire une incision le long de la colonne vertébrale. Séparer la peau des muscles sous-jacents.
2. Faire deux incisions de chaque côté de la vertèbre pour séparer les muscles sous-cutanés. Puis couper chaque tendon des muscles qui se fixent sur le côté de la vertèbre de chaque côté.
3. Utilisant le forceps émoussé et une curette fine, retirer le reste du muscle de la face dorsale des vertèbres autour des apophyses épineuses d'identifier clairement chaque vertèbre individuelle.
4. Identifier les vertèbres T13 et L1. T13 est la dernière vertèbre à des nervures ci-joint. La colonne vertébrale wmal être immobilisé à l'aide des pinces Cunningham moelle épinière vertébrales (Stoelting Co.). Placer les pinces vertébrales, de chaque côté de T13 et L1. Veillez à ne pas comprimer la moelle épinière, mais mettre un peu de tension dans l'axe longitudinal. Vérifiez que la colonne vertébrale soit bien fixée en appuyant doucement avec une pince.
5. Utilisation rongeurs fines, retirer les apophyses épineuses des vertèbres, puis les lames sur T13 et L1, exposant ainsi la moelle épinière.
6. Couvrir le cordon médullaire exposée avec de petits morceaux de coton imbibés ou spongel avec du sérum physiologique pour éviter la dessiccation.
7. Placez une coutume de bain en plastique sur le dessus du dos, qui entoure la moelle épinière. Fixez le bain en place avec du fil de soie 4/0. Assurez-vous que le bain est étanche en la scellant avec Kwik-Cast étanchéité (WPI).
8. Une fois que le Kwik-Cast a séché, retirez le coton couvrant la moelle épinière, et remplir la baignoire avec de l'huile minérale.
9. Utilisation Dumont 5 pinces et ciseaux très fins iris, tirez doucement sur le second duréer entourant la moelle épinière, et ouvrez-le aussi loin que possible dans les deux sens. Plier la durée de chaque côté de la moelle épinière.
10. Abaisser la plate-forme surélevée sur laquelle la souris est située de manière à maintenir suspendu par la pince vertébrale.
11. Utilisez une autre pince vertébrale pour serrer une apophyse épineuse de la région sacrée pour soutenir la région lombaire de l'animal.
12. Dispositif de serrage troisième est utilisé pour immobiliser la patte arrière droite et de la cheville, à un angle de flexion de 90 ° au niveau du genou.

11. Dissection du tendon d'Achille

1. Avec la branche coudée à 90 ° au niveau du genou et de la cheville, retirer la toile recouvrant la zone des pattes arrière, et disséquer le tendon d'Achille sans le tissu environnant. Disséquer le plus possible le triceps sural du tissu environnant ainsi.
2. Couper le tendon du muscle plantaire près de calcanéum, puis coupez-le de nouveau pour enlever complètement le tendon.
3. En utilisant une aiguille fileté, fixez fil 6/0 de la soie à travers èmee tendon d'Achille et faire un noeud triple autour du tendon.
4. Placez le capteur de force près du nœud, coupez la partie distale du tendon, et l'attacher à l'aide du capteur de force le fil de soie.
5. Insérez deux longueurs de fil d'acier inoxydable sous l'aponévrose des muscles triceps sural. Ces fils sont reliés à un amplificateur de courant alternatif pour l'enregistrement extracellulaire EMG.
6. Placez le nerf fibulaire commun et le nerf tibial sur deux électrodes bipolaires crochet.
7. Placer le triceps sural nerf sur la cathode d'une électrode de crochet, avec l'anode de toucher un muscle à proximité.
8. Connecter tous les électrodes de stimulation à une unité d'isolement.
9. Placer une électrode de bille sur la surface dorsale de la moelle épinière, relié à un amplificateur AC extracellulaire à enregistrer les potentiels de cordon dos. Placez une électrode de référence Ag / AgCl en contact avec un muscle du dos.

12. Douze Étapes

Stimuler le nerf triceps suralà l'aide de 50 microsecondes carré impulsion d'intensité croissante à basse fréquence (<1 Hz) jusqu'à ce que l'amplitude contraction maximale est observée. Déplacer lentement le transducteur de force pour étirer le muscle tout en surveillant l'amplitude de la réponse contractile jusqu'à l'amplitude contraction atteint un maximum.

13. Les enregistrements intracellulaires de motoneurones

A partir de ce moment-là, des techniques électrophysiologiques sont utilisés pour préparer une électrode intracellulaire, pénétrer dans un neurone dans la moelle épinière et l'identifient comme un motoneurone.

1. Tirez une micropipette de verre à une extrémité ~ 1 um à l'aide d'un extracteur de pipette (P-97 Micropipette Puller, Instruments Sutter). Remplir l'électrode avec une solution de KCl 3M (résistance de l'électrode de 10-20 MQ).
2. L'utilisation d'un micropositionneur, conduire la micropipette, connecté à un amplificateur intracellulaire (Axoclamp 2B, Axon Instruments) dans la moelle épinière. Surveiller les potentiels de champs locaux provoquées par la stimulation de la ehaque nerf pour localiser le parc de véhicules du triceps sural.
3. Soigneusement approcher motoneurones putatifs tout en surveillant la résistance de la microélectrode. Lorsque l'on pousse contre une membrane, la résistance augmente. La pénétration peut parfois être facilitée en utilisant le «buzz» en fonction de l'amplificateur intracellulaire.

14. Procédure euthanasie

A la fin de l'expérience, l'animal est euthanasié par une surdose de pentobarbital (210 mg / kg IV), suivie par décapitation.

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Résultats

La figure 1 montre comment identifier un motoneurone du groupe triceps sural après la pénétration. Au intensité de la stimulation faible, seule une EPSP monosynaptique peuvent être observées (figure 1A). A plus haute intensité, l'EPSP peut être suffisamment importante pour déclencher une "orthodromique" pic (figure 1B). Au intensité de stimulation encore plus élevé, un antidromique tout-ou-rien pic apparaît, avec une latence plus courte que l&...

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Discussion

La préparation décrite ici est la première qui permet, chez la souris adulte, simultanée d'un enregistrement intracellulaire motoneurone lombaire et la mesure de la force produite par les fibres musculaires innervées par son axone.

En raison de la petite taille de l'animal, les compétences chirurgicales nécessaires pour cette préparation peut être difficile à acquérir. Cependant, une fois ces compétences sont maîtrisées, toute la chirurgie peut être réalisée en trois...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Le sulfate d'atropine	Aguettant
Methylprenidsolone	Pfizer	Solu-Medrol
Pentobarbital de sodium	Sanofi-Aventis	Pentobarbital
La kétamine
Xylazine
Glucose
Expanseur du volume plasmatique	Roger Bellon	Plasmagel
Ciseaux à bouts ronds	FST	14079-10
Blunt ciseaux fins	FST	15025-10
Vannas Ciseaux Spring	FST	15002-08
Fine pince à dents de scie	FST	11370-32
Fine pince à dents de scie	FST	11370-31
Cunningham Adaptateur épinière	Stoelting Co.
Kwik-Cast étanchéité	WPI	# KWIK-CAST
Ventilateur	CWE Inc	SAR-830/AP
Capnographe	CWE Inc	μcapstar
Couverture chauffante	Harvard Apparatus	507221F
Amplificateur intracellulaire	Axon Instruments	Axoclamp 2B
Pipette extracteur	Sutter Instruments	P-97
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G