Grabación simultánea intracelular de una motoneurona lumbar y la Fuerza producida por su unidad motora en el ratón adulto<em&gt; En vivo</em

Resumen

Este nuevo método permite la grabación simultánea intracelular de una motoneuron adulto solo ratón y la medición de la fuerza producida por sus fibras musculares. La investigación combinada de las propiedades eléctricas y mecánicas de las unidades motoras en los animales normales y genéticamente modificadas es un gran avance para el estudio del sistema neuromuscular.

Resumen

La motoneurona espinal ha sido durante mucho tiempo un buen sistema modelo para el estudio de la función neural, ya que es una neurona del sistema nervioso central con las propiedades únicas de (1) con objetivos fácilmente identificables (las fibras musculares) y por lo tanto tiene una función muy conocida (para controlar la contracción muscular), (2) ser el objetivo convergente de muchas redes espinales y descendente, de ahí el nombre de "vía final común", y (3) que tiene una gran soma que hace posible penetrar en ellos con afilados electrodos intracelulares . Además, cuando se estudió in vivo, es posible registrar simultáneamente la actividad eléctrica de las neuronas motoras y la fuerza desarrollada por sus objetivos musculares. Realización de grabaciones intracelulares de las neuronas motoras en vivo por lo tanto poner el experimentador en la posición única de ser capaz de estudiar, al mismo tiempo, todos los compartimentos de la "unidad de motor" (el nombre dado a la motoneurona, su axón, ylas fibras musculares que inerva ^1): los insumos que inciden en la motoneurona, las propiedades electrofisiológicas de las neuronas motoras, y el impacto de estas propiedades de la función fisiológica de las neuronas motoras, es decir, la fuerza producida por su unidad de motor. Sin embargo, este enfoque es muy difícil porque la preparación no puede ser paralizada y por lo tanto la estabilidad mecánica para el registro intracelular se reduce. Así, este tipo de experimentos sólo se ha logrado en los gatos y en ratas. Sin embargo, el estudio de los sistemas motores espinales podría dar un salto formidable si era posible llevar a cabo experimentos similares en ratones normales y genéticamente modificados.

Por razones técnicas, el estudio de las redes espinal en ratones se ha limitado principalmente a recién nacidos en preparaciones in vitro, donde las neuronas motoras espinales y las redes son inmaduros, las motoneuronas son separados de sus objetivos, y cuando se estudió en rodajas, el motoneurons se separan de la mayoría de sus entradas. Hasta hace poco, sólo algunos grupos habían logrado realizar grabaciones intracelulares de las neuronas motoras en vivo ^2-4, incluyendo nuestro equipo, que publicó una nueva preparación que nos ha permitido obtener grabaciones muy estables de las motoneuronas in vivo en ratones adultos ^5,6. Sin embargo, estos registros se obtuvieron en animales paralizados, es decir, sin la posibilidad de grabar la salida de la fuerza de estas motoneuronas. A continuación les presentamos una extensión de esta preparación original en el que hemos sido capaces de obtener grabaciones simultáneas de las propiedades electrofisiológicas de las neuronas motoras y de la fuerza desarrollada por su unidad de motor. Este es un logro importante, ya que nos permite identificar los diferentes tipos de neuronas motoras en base a su perfil de la fuerza, y revelando así su función. Junto con los modelos genéticos perturbar circuitos espinal segmentaria ^7-9, o reproducting humano enferme^10,11 sí, esperamos que esta técnica es una herramienta esencial para el estudio del sistema motor espinal.

Protocolo

1. Paso uno

Medicación preanestésica: 10-15 min antes de la inducción de la anestesia, inyectar atropina (0,20 mg / kg) y methylprenidsolone (0,05 mg) por vía subcutánea para prevenir la salivación y edema, respectivamente.

2. Paso dos

La inducción de la anestesia: inyectar pentobarbital sódico (70 mg / kg) o una mezcla de ketamina / xilazina (100 mg / kg y 10 mg / kg, respectivamente) por vía intraperitoneal. Vamos a pasar por debajo de la del ratón hasta que no reflejo del pellizco dedo del pie se puede conseguir. Si la anestesia parece demasiado clara, completar con 1/4 de la dosis.

3. Paso tres

* Nota: esta cirugía es un procedimiento terminal.

Cuando un plano quirúrgico de anestesia ha sido alcanzado, transferir el ratón sobre una manta caliente levantado en posición prona.

1. Cubra el hocico del ratón con una máscara de la entrega de O ₂ puro con un caudal de alrededor de 100 ml / min.
2. Uso de una cortadora de cabello, afeitarse la región dorsal de la nuca del cuello hasta la base de la cola.
3. Afeitado también la extremidad posterior derecha.
4. Mueva el ratón a la posición supina, pero tenga cuidado de dejar la mascarilla de oxígeno en su lugar.

4. Paso cuatro

Asegure el ratón en el lugar con suturas enrolladas alrededor de los miembros y asegurados en las cuatro esquinas de la superficie de trabajo.

5. Paso cinco

Insertar una sonda de temperatura para controlar la temperatura del núcleo del ratón. Ajuste manta de calefacción / potencia de la lámpara para mantener la temperatura de núcleo entre 36 ° C y 38 ° C.

6. La traqueotomía y ventilación artificial

1. Con unas tijeras romas, haga un corte a través de la tráquea y tire de la piel de distancia en ambos lados.
2. Utilizando pinzas romas, desgarrar la glándula salival para exponer dos músculos delgados (esternohioideo) que cubren la tráquea.
3. Con unas pinzas romas, separe el musc dosles a lo largo de su separación medial para revelar la tráquea.
4. El uso de un Dumont 7 pinzas, deslizar dos longitudes de sutura de seda 4.0 en la tráquea.
5. Hacer un corte transversal en la tráquea entre dos anillos cartilaginosos pero tener cuidado de no completamente sección de la tráquea.
6. Insertar el tubo traqueal por la tráquea, a continuación, asegurar en ambos lados de la abertura de inserción atando las suturas del mismo. El tubo traqueal está conectado a un ventilador ratón (SAR-830/AP, CWE Inc.) y un capnógrafo (μcapstar, CWE Inc.). El ventilador está conectado, a través de una bolsa de cumplimiento, a una fuente de puro O _2. Ajuste de los parámetros del ventilador (frecuencia respiratoria 100-150 lpm, final de la espiración volumen 170-310 l), de modo que el ratón no está luchando contra la ventilación artificial y la pCO final de la espiración ₂ es estable entre un 4 y 5%.

7. La colocación de los catéteres intravenosos

1. Utilizando técnicas de disección roma, exponer la yugularvena en un lado del cuello. En este nivel, la vena yugular se divide en dos troncos principales, las venas faciales anterior y posterior.
2. Realice los siguientes pasos dos veces, uno para cada uno de estos troncos:
   1. Usando Dumont 4 o 5 fórceps, separe con cuidado la vena de su tejido circundante conjuntivo.
   2. Usando Dumont 7 pinzas, deslizar dos longitud de 6,0 puntos de seda debajo de la vena. separar la medida de lo posible a lo largo de la longitud de la vena.
   3. Colocar una grapa de vaso pequeño en el lado proximal de la vena (el lado más cercano al corazón), y atar el lado distal de la vena.
   4. Con unas tijeras iris muy finas, hacer una pequeña incisión transversal en la vena, no teniendo mucho cuidado a la sección de la vena por completo.
   5. Insertar un catéter 1FR precargada (premicath, Vygon) en la abertura, hasta la grapa de vaso.
   6. Sosteniendo la vena y el catéter juntos en una Dumont 4 pinzas, retire con cuidado el clip buque, a continuación, empuje el catéter unos pocos mormilímetros correos en la vena.
   7. Fijar el catéter mediante la vinculación con las dos suturas en ambos lados de la inserción.
3. Uno de los catéteres está conectado a una jeringa o una bomba de jeringa para inyectar dosis complementarias de anestésico siempre que sea necesario (generalmente cada min 10-30). La dosis IV es o bien 6 mg / kg de pentobarbital sódico o 1250 40 g / kg / min de ketamina / xilazina ^12. El otro catéter se conecta a una bomba de jeringa para una infusión intravenosa lenta (50 l / h) de una solución de glucosa al 4% que contenía NaHCO ₃ (1%) y plasmion (14%).

8. Cierre la piel del cuello con la aguja y la sutura, y devolver el ratón a la posición prona

9. La disección de los músculos de las extremidades posteriores y nervios

1. Con unas tijeras, hacer una incisión desde la parte superior del muslo en el tendón de Aquiles. Separar la piel de los músculos subyacentes, teniendo cuidado de no dañar los vasos sanguíneos. Cauterizar según sea necesario.
2. Identificar el borde anterior del bíceps femoral, que aparece como una línea blanca corriendo por el muslo. Usando tijeras, abra cuidadosamente a lo largo de la línea de la rodilla hasta el final a hueso de la cadera. Separe los músculos. El nervio ciático es ahora visible en el bíceps femoral.
3. Diseccionar cuidadosamente el bíceps femoral. Cauterize / ligadura según sea necesario para prevenir el sangrado. El bíceps femoral puede ser totalmente eliminado o simplemente recostado para exponer el nervio ciático y el tríceps sural músculos.
4. Diseccionar el nervio sural.
5. Con 8/0 hilos de seda, atar la parte distal del nervio peroneo común y corte distal al nudo. Disección del nervio hasta el final para arriba, tan cerca de la cadera como sea posible.
6. Identifique el nervio tibial entre los nervios peroneo común y Sural. Entre las diferentes ramas del nervio tibial, identificar las ramas que inervan el tríceps sural de las ramas que van más profunda (en adelante el nervio tibial).
7. Con 8/0 sedahilo, unir todas las ramas del nervio tibial, manteniendo intactas las ramas que inervan el tríceps sural. Cortar el nervio tibial distal a la del nudo y diseccionar el nervio hasta la medida de lo posible.
8. Cubrir toda la extremidad posterior con una gasa embebida con solución salina para prevenir la desecación mientras que proceder con el paso siguiente.

10. Laminectomía

1. Con unas tijeras, hacer una incisión a lo largo de la columna vertebral. Se separa la piel de los músculos subyacentes.
2. Hacer dos incisiones a cada lado de las vértebras a separar los músculos subcutáneos. A continuación, cortar cada tendón de los músculos que se conectan en el lado de las vértebras a cada lado.
3. Utilizando pinzas romas y una cureta fina, retire el resto del músculo en el lado dorsal de las vértebras alrededor de las apófisis espinosas para identificar claramente cada vértebra individual.
4. Identificar vértebras T13 y L1. T13 es la última vértebra tener costillas adjunto. La columna vertebral wenfermo puede inmovilizar con las abrazaderas Cunningham Médula Espinal vertebrales (Stoelting Co.). Coloque las abrazaderas de la columna vertebral en cada lado de T13 y L1. Tenga cuidado de no comprimir la médula espinal, pero poner un poco de tensión en el eje longitudinal. Compruebe que la columna vertebral se asegura bien presionando hacia abajo suavemente con fórceps.
5. Usando pinzas gubias finas, eliminar los procesos espinales entonces las láminas sobre T13 y L1, exponiendo así la médula espinal.
6. Cubra la médula espinal expuesta con pequeños trozos de algodón o spongel absorbido con solución salina para evitar la desecación.
7. Colocar una costumbre baño hecho de plástico en la parte superior de la espalda, que rodea la médula espinal. Fije la bañera en su lugar con 4/0 hilos de seda. Asegúrese de que el baño es a prueba de agua, sellando con Kwik-Cast sellador (WPI).
8. Una vez que el Kwik-Cast se ha secado, retire el algodón que cubre la médula espinal, y llenar la bañera con aceite mineral.
9. Usando Dumont 5 pinzas y tijeras iris muy finos, tire suavemente de la pareja durar rodea la médula espinal, y lo abre en la medida de lo posible en ambas direcciones. Doble la duramadre en cada lado de la médula espinal.
10. Bajar la plataforma elevada en la que el ratón está mintiendo a fin de mantenerlo suspendido por la abrazadera vertebral.
11. Use otra abrazadera vertebral para sujetar una apófisis espinosa de la región sacra para apoyar la región de la espalda del animal.
12. Una abrazadera tercero se utiliza para inmovilizar la extremidad posterior derecha y el tobillo, doblada en un ángulo de 90 grados a la rodilla.

11. Aquiles Tendón Disección

1. Con la extremidad doblada a 90 ° en la rodilla y en el tobillo, quitar la gasa que cubre el área de miembros posteriores, y diseccionar el tendón de Aquiles libre de los tejidos circundantes. Diseccionar tanto como sea posible el tríceps sural del tejido circundante también.
2. Cortar el tendón del músculo plantar de cierre en el calcáneo, entonces cortar de nuevo para eliminar completamente el tendón.
3. Usando una aguja roscada, coloque 6/0 seda hilo a través de the tendón de Aquiles y hacer un nudo triple alrededor del tendón.
4. Coloque el transductor de fuerza cerca del nudo, corte la parte distal del tendón, y adjuntarlo al transductor de fuerza con el hilo de seda.
5. Coloque dos trozos de alambre de acero inoxidable debajo de la fascia de los músculos tríceps sural. Estos cables están conectados a un amplificador extracelular de CA para la grabación de EMG.
6. Coloque el nervio peroneo común y el nervio tibial en dos electrodos bipolares gancho.
7. Coloque el nervio tríceps sural en el cátodo de un electrodo de gancho, con el ánodo de tocar un músculo cercano.
8. Conecte todos los electrodos de estimulación a una unidad de aislamiento.
9. Colocar un electrodo de bola en la superficie dorsal de la médula espinal, conectado a un amplificador extracelular de CA a registrar los potenciales de médula dorso. Colocar un electrodo de referencia de Ag / AgCl en contacto con un músculo de la espalda.

12. Paso Doce

Estimular el nervio tríceps suralusando un 50 microsegundos pulso cuadrado de intensidad creciente a una frecuencia baja (<1 Hz), hasta que la amplitud de contracción máxima se observa. Lentamente mover el transductor de fuerza para estirar el músculo, mientras que el control de la amplitud de la respuesta de contracción hasta que la amplitud de contracción alcanza un máximo.

13. Registros intracelulares de las neuronas motoras

Desde este punto en adelante, las técnicas electrofisiológicas estándar se utilizan para preparar un electrodo intracelular, una neurona penetrar en la médula espinal y lo identifican como un motoneuron.

1. Tire de una micropipeta de vidrio a una punta de m ~ 1, utilizando un extractor de pipeta (P-97 Micropipeta Puller, Instrumentos Sutter). Llenar el electrodo con una solución de KCl 3M (resistencia del electrodo de 10-20 mW).
2. Uso de un microposicionador, conducir la micropipeta, conectado a un amplificador intracelular (Axoclamp 2B, Axon Instruments) en la médula espinal. Monitorear los potenciales de campo locales producidas por la estimulación de correoada para localizar el nervio motor de la piscina del tríceps sural.
3. Cuidadosamente acercarse motoneuronas putativo mientras se monitoriza la resistencia del microelectrodo. Cuando se empuja contra una membrana, la resistencia aumenta. Penetración en algún momento puede ser facilitado mediante el "buzz" la función del amplificador intracelular.

14. La eutanasia Procedimiento

Al final del experimento, los animales se sacrificaron mediante una sobredosis de pentobarbital (210 mg / kg IV), seguido de decapitación.

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Resultados

La Figura 1 muestra cómo identificar un motoneuron del grupo tríceps sural después de la penetración. En la intensidad de estimulación mínima, sólo una EPSP monosináptico se puede observar (figura 1A). A mayor intensidad, la EPSP podría ser lo suficientemente grande como para provocar una "ortodrómica" punta (Figura 1B). En la intensidad de estimulación incluso superior, un todo-o-nada antidrómica pico aparece, con una latencia más corta que la EP...

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Discusión

La preparación se describe aquí es el primero que permite, en el ratón adulto, la grabación simultánea intracelular de una motoneuron lumbar y la medición de la fuerza producida por las fibras musculares inervadas por su axón.

Debido al pequeño tamaño del animal, las habilidades quirúrgicas requeridas para esta preparación puede ser difícil de adquirir. Sin embargo, una vez que esas habilidades se dominan, toda la cirugía se puede realizar en tres horas, y los animales pueden so...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Atropina sulfato	Aguettant
Methylprenidsolone	Pfizer	Solu-Medrol
Sodio pentobarbital	Sanofi-Aventis	Pentobarbital
La ketamina
Xilazina
Glucosa
Expansor plasmático	Roger Bellon	Plasmagel
Tijeras de punta roma	FST	14079-10
Blunt tijeras finas	FST	15025-10
Tijeras Vannas Primavera	FST	15002-08
Fine fórceps dentado	FST	11370-32
Fine fórceps dentado	FST	11370-31
Cunningham espinal Adaptador	Stoelting Co.
Kwik-Cast sellador	WPI	# KWIK-CAST
Ventilador	CWE Inc	SAR-830/AP
Capnografo	CWE Inc	μcapstar
Calefacción manta	Harvard Apparatus	507221F
Amplificador intracelular	Axon Instruments	Axoclamp 2B
Pipetear extractor	Sutter Instruments	P-97
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G