הקלטה תאית סימולטני של Motoneuron מותנה והחיל הופק על ידי יחידת המנוע שלה בעכבר למבוגרים<em&gt; בחי</em

Marin Manuel; C.J. Heckman

doi:10.3791/4312

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

שיטה חדשה זו מאפשרת הקלטה התאית סימולטני של motoneuron אחת מבוגר עכבר והמדידה של הכח הנוצר על ידי סיבי השריר שלה. החקירה בשילוב של תכונות החשמליות ומכאניות של יחידות מוטוריות בבעלי חיים רגילים ועבר שינוי הגנטי היא פריצת דרך בחקר מערכת התוקפת.

Abstract

Motoneuron השדרה כבר זמן רב מערכת מודל טובה ללימוד תפקוד עצבי כי זה תא עצב של מערכת העצבים המרכזית עם המאפיינים הייחודיים של (1) יש מטרות לזיהוי בקלות (את סיבי שריר) ויש לו פונקציה מאוד ידועה ולכן (כדי לשלוט בכיווץ שריר), (2) להיות היעד המתכנס של רשתות רבות בעמוד שדרה ויורדות, ומכאן שמו של "מסלול משותף סופי"; ו (3) שסומא גדול המאפשר לחדור אליהם עם אלקטרודות התאית החדה . יתר על כן, כאשר למדו בvivo, ניתן לרשום את הפעילות החשמלית של תאי עצב האחראים ולכח שפותח על ידי מטרותיהם שרירים בו זמנית. ביצוע הקלטות תאיות של תאי עצב אחראים in vivo לכן לשים experimentalist בעמדה הייחודית של להיות מסוגל ללמוד, באותו הזמן, את כל המדורים של "יחידת המנוע" (השם שניתן לmotoneuron, האקסון שלו, וסיבי השריר זה innervates ^1): את התשומות שולטו בmotoneuron, את המאפיינים של אלקטרו motoneuron, ואת ההשפעה של מאפיינים אלה על התפקוד הפיזיולוגי של תאי עצב האחראים, כלומר את הכח הנוצר על ידי יחידת המנוע שלה. עם זאת, גישה זו היא מאוד מאתגרת בגלל ההכנה לא יכולה להיות משותקת ובכך היציבות המכאנית להקלטה התאית היא מופחתת. לכן, סוג זה של ניסויים הושג רק בחתולים ובעכברים. עם זאת, המחקר של מערכות מוטוריות בעמוד שדרה יכול לעשות קפיצה אדירה אם זה היה אפשרי לביצוע ניסויים דומים בעכברים נורמלים ומהונדס גנטיים.

מסיבות טכניות, המחקר של הרשתות בעמוד השדרה בעכברים יש בעיקר מוגבל לילוד בהכנות חוץ גופייה, שבו תאי עצב האחראים ורשתות השדרה הם לא בוגרים, על תאי עצב האחראים מופרדים מהמטרות שלהם, וכשלמד בפרוסות, מוtoneurons מופרדים ממרבית התשומות שלהם. עד לאחרונה, רק כמה קבוצות הצליחו לבצע הקלטות תאיות של תאי עצב אחראים in vivo ^2-4, כולל צוות שלנו שפרסם הכנה חדשה שאפשרה לנו להשיג הקלטות יציבות מאוד של תאי עצב אחראים in vivo בעכברים בוגרים ^5,6. עם זאת, הקלטות אלה התקבלו בבעלי חיים משותקים, כלומר ללא האפשרות להקליט את תפוקת הכח של תאי עצב האחראים האלה. כאן אנו מציגים הארכת הכנה מקורית זה, בו הצליח להשיג הקלטות בו זמניות של את המאפיינים אלקטרופזיולוגים של תאי עצב האחראים ושל הכח שפותח על ידי יחידת המנוע שלהם. מדובר בהישג חשוב, שכן היא מאפשרת לנו לזהות את הסוגים השונים של תאי עצב אחראים המבוססים על פרופיל כוחם, ובכך חושף את תפקידם. יחד עם מודלים גנטיים מפריעים מעגלים מגזריים שדרת ^7-9, או reproducting disea האנושיse ^10,11, אנו מצפים בטכניקה זו כדי להיות כלי חיוני למחקר של מערכת מוטורית בעמוד שדרה.

Protocol

1. צעד אחד

תרופות טרום הרדמה: 10-15 דקות לפני האינדוקציה של הרדמה, להזריק אטרופין (0.20 מ"ג / ק"ג) וmethylprenidsolone (0.05 מ"ג) תת cutaneously למנוע ריור ובצקת, בהתאמה.

2. שלב השני

אינדוקציה של הרדמה: להזריק נתרן פנטוברביטל (70 מ"ג / ק"ג) או תערובת של קטמין / xylazine (100 מ"ג / ק"ג ו 10 מ"ג / ק"ג, בהתאמה) התוך peritoneally. בואו העכבר ללכת תחת עד ניתן להשיג שום רפלקס קמצוץ בוהן. אם ההרדמה נראית בהירה מדי, להשלים עם 1/4 מהמנה.

3. שלב שלישי

* הערה: הניתוח הזה הוא הליך מסוף.

כאשר מטוס כירורגית של הרדמה הושג, להעביר את העכבר על שמיכה חמה גדלה בתנוחת שכיבה.

כסה את פרצופו של העכבר עם מסכת האספקה O הטהור ₂ בזרימה סביב 100 מ"ל / דקה.
שבי גם hindlimb הנכון.
תהפוך עכבר למצב שכיבה אבל דואגים להשאיר את מסכת החמצן במקום.

4. שלב רביעי

אבטח את העכבר במקום עם תפרים הניחו סביב האיברים ומאובטחים בארבע הפינות של משטח העבודה.

5. השלב החמישי

הכנס בדיקת טמפרטורה לניטור טמפרטורת ליבת העכבר. התאם חימום שמיכה / כוח מנורה כדי לשמור על טמפרטורת ליבה בין 36 ° C ו 38 ° C.

6. קנה נשימה והנשמה מלאכותית

באמצעות מספריים קהים, לעשות חתך מעל קנה הנשימה ולמשוך את העור בשני הצדדים.
שימוש במלקחיים בוטים, לקרוע לגזרים את בלוטות הרוק, כדי לחשוף את שני שרירים דקים (Sternohyoid) המכסים את קנה נשימה.
שימוש במלקחיים בוטים, להפריד בין שתיים muscles יחד ההפרדה המדיאלי שלהם כדי לחשוף את קנה הנשימה.
שימוש של 7 מלקחי דומון, להחליק 2 אורך תפר משי 4.0 מתחת לקנה הנשימה.
לעשות חתך רוחבי בקנה הנשימה שבבין שתי טבעות סחוס אך היזהר שלא לסעיף קנה הנשימה לחלוטין.
הכנס את הצינור לקנה הנשימה קנה נשימה יורד, ואז לאבטח אותו משני צדי פתח הכניסה על ידי קשירת התפרים מעליה. קנה נשימת הצינור מחובר למכונת נשמת עכבר (SAR-830/AP, CWE Inc) וcapnograph (μcapstar, CWE Inc). המאוורר מחובר דרך שקית עמידה, למקור הטהור O _2. התאם את הפרמטרים של ההנשמה (100-150 פעימות לדקת קצב נשימה, 170-310 μl נפח סוף הגאות) כך שהעכבר לא נלחם נגד המערכות להנשמה המלאכותיות וPCO סוף גאות ₂ הוא יציב בין% 4 ו 5.

7. מיקום של קווים תוך הוורידים

באמצעות שימוש בטכניקות נתיחה בוטות, חושף את וריד הצווארוריד בצד אחד של הצוואר. ברמה זו, וריד הצוואר מתפצל לשני גזעים גדולים, עורקים קדמיים ואחוריים פנים.
בצע את השלבים הבאים פעמים, אחד שנקבע לכל אחד מהגזעים האלה:
1. בעזרת 4 או 5 מלקחי דומון, להפריד בזהירות הווריד מהרקמה מקשרת סביבתה.
2. באמצעות 7 מלקחי דומון, להחליק 2 אורך של 6.0 תפרי משי תחת הווריד. להפריד ביניהם ככל האפשר לאורכו של הווריד.
3. הנח קליפ כלי קטן בצד הפרוקסימלי של הווריד (הצד הקרוב ללב), ולקשור את הצד הדיסטלי של הווריד.
4. בעזרת מספרי איריס יפים מאוד, עושה חתך רוחבי קטן בווריד, בזהירות רבה, שלא סעיף הווריד לחלוטין.
5. הכנס קטטר 1Fr מראש ו( premicath, Vygon) בפתיחה, עד לקליפ הכלי.
6. מחזיק את הווריד והקטטר יחד ב4 מלקחי דומון, להסיר את סרטון הכלי בזהירות, ואז דוחף את הקטטר כמה מורמילימטרי דואר לווריד.
7. Secure את הקטטר על ידי קשירתו בשני התפרים בשני הצדדים של הכניסה.
אחד מהצנתרים מחובר למזרק או משאבת מזרק להזריק מינונים משלימים של חומרי הרדמה בעת צורך (כל 10-30 דקות בדרך כלל). המנה הרביעית היא גם 6 מ"ג / ק"ג של נתרן פנטוברביטל או 1250 40 מיקרוגרם / ק"ג / דקה של קטמין / ¹² xylazine. קטטר האחר מחובר למשאבת מזרק לעירוי תוך ורידים איטי (50 μl / שעה) של 4% פתרון גלוקוז המכיל ₃ NaHCO (% 1) וplasmion (14%).

8. סגור את עור הצוואר עם מחט ותפר, והחזר את העכבר לתנוחת שכיבה

9. נתיחה של שרירי הגפה-הינד ועצבים

בעזרת מספריים, עושה חתך מהחלק העליון של הירך בגיד אכילס. להפריד את העור מהשרירים הבסיסיים, נזהר שלא לפגוע בכלי דם. לצרוב במידת צורך.
זהה את הקצה הקדמי של Biceps Femoris, המופיע כקו לבן היורד על ירכו. בעזרת מספריים, פתח בזהירות לאורך הקו מהברך עד לעצם הירך. הפרד את השרירים. עצב הירך נראה כעת תחת Biceps Femoris.
זהירות לנתח את Femoris Biceps. לצרוב / קשירה כנדרשת כדי למנוע דימום. Biceps Femoris ניתן להסיר לחלוטין או פשוט נשכב על מנת לחשוף את גיד הנשה ואת שרירי Triceps Surae.
לנתח את עצב Sural.
שימוש בחוט משי 8/0, לקשור את חלקו האחורי של עצב Peroneal קומון וחתוך לדיסטלי את הקשר. מנתח את העצבים כל הדרך למעלה, קרוב לירך ככל האפשר.
זהה את עצב הטיביאלי בין עצבי Peroneal וSural הנפוצים. בין הענפים השונים של עצב הטיביאלי, לזהות ענפי innervating Surae Triceps מהענפים שהולכים עמוקים יותר (יקרא להלן עצב הטיביאלי).
שימוש במשי 8/0חוט, לקשור יחד את כל הסניפים של עצב הטיביאלי תוך שמירה על שלמות הסניפים innervating Surae Triceps. חותך את עצב הטיביאלי distally לקשר ולנתח את העצבים ככל האפשר.
מכסה את כל hindlimb עם גזה ינקה עם מי מלח כדי למנוע dessication בעת הליך בשלב הבא.

10. Laminectomy

בעזרת מספריים, עושה חתך לאורך עמוד השדרה. להפריד את העור מהשרירים הבסיסיים.
לעשות שני חתכים בכל צד של החוליות להפריד את השרירים תת עורי. ואז חותך כל גיד של השרירים המחברים בצד של חוליות בכל צד.
שימוש במלקחיים קהים ומגרדת עדינה, הסר את שארית השרירים בצד הגבי של החוליות סביב תהליכי spinous לזהות בבירור כל חוליה וחוליה.
זהה את חוליות T13 וL1. T13 היא החוליה האחרונה שיש לי צלעות מצורפות. עמוד שדרת wחולה להיות משותק באמצעות מהדק קנינגהם חוט השדרה (בחוליות Stoelting ושות). מקם את התפסים בעמוד שדרה בכל צד של T13 וL1. יש להיזהר שלא לדחוס את חוט השדרה, אך הכניס קצת מתח בציר האורך. בדקו שעמוד השדרה מאובטח היטב על ידי לחיצה בעדינות עם מלקחיים.
שימוש rongeurs העדין, מסיר את תהליך השדרה אז רבדים על T13 וL1, ובכך חושף את חוט השדרה.
כריכת חוט השדרה נחשף בפיסות קטנות של כותנה או spongel ינקו עם מי מלח למניעת התייבשות.
הנח אמבטית מנהג עשה פלסטיק על גבי החלק האחורי, המקיפה את חוט השדרה. אבטח את האמבטיה בדירה באמצעות חוט משי 4/0. ודא שהאמבטיה היא עמידה למים על ידי אטימתה עם האיטום Kwik-יצוק (WPI).
ברגע Kwik-היצוק התייבש, הסר את כיסוי כותנת חוט השדרה, ולמלא את האמבטיה עם שמן מינרלים.
באמצעות 5 מלקחיים דומון ומספרי איריס יפים מאוד, משוך בעדינות על תאומת הדורהr סביב חוט השדרה, ולפתוח אותו במידת ההאפשר הוא בכיוון. מקפל את הדורה בכל צד של עמוד השדרה.
מנמיך את הפלטפורמה המוגבהת שעליה את העכבר משקר כדי לשמור אותו הושעה על ידי מהדק השדרה.
השתמש במהדק חוליות אחרת כדי לצבוט את תהליך spinous של אזור עצם העצה לתומך באזור האחורי של החיה.
מהדק שלישי נועד כדי לשתק hindlimb וקרסול ימין, מתח בזווית של 90 מעלות בברך.

11. Dissection הגיד אכילס

עם האיבר הכפוף בזווית של 90 מעלות בברך ובקרסול, להסיר את התחבושת מכסה את אזור hindlimb, ולנתח את הגיד ללא רקמה הסובבת אכילס. לנתח ככל האפשר Surae Triceps מרקמות גם כן.
חותך את הגיד של שריר Plantaris הקרוב לcalcaneus, חתך אותו שוב כדי להסיר את הגיד לגמרי.
באמצעות מחט מושחלת, לצרף חוט משי 6/0 עד הדואר גיד אכילס ולהפוך את קשר משולש סביב הגיד.
הנח את מתמר הכח הקרוב לפקעת, לחתוך חלק הדיסטלי של הגיד, ולצרף אותו למתמר הכח באמצעות חוט משי.
הוסף שני אורכים של חוט נירוסטה מתחת fascia של שרירי Surae triceps. חוטים אלה מחוברים למגבר AC תאי להקלטת EMG.
הנח את עצב Peroneal המשותף ועצב הטיביאלי על שתי אלקטרודות וו דו קוטביות.
הנח את עצב Surae Triceps על הקתודה של האלקטרודה וו, עם האנודה נוגעת שרירים סמוכים.
חבור את כל אלקטרודות הגירוי ליחידת בידוד.
הנח אלקטרודה כדור על פני השטח הגבי של חוט השדרה, מחוברים למגבר AC תאי להקליט פוטנציאלי טבורי dorsum. הנח אלקטרודה השוואתית Ag / AgCl במגע עם שריר אחורי.

12. שלב שנתי עשר

לגרות את עצבי Surae Tricepsבאמצעות דופק 50 μsec מרובע של עצמה גוברת בתדירות נמוכה (<1 רץ) עד משרעת עווית מרבית הוא ציין. זז לאט את מתמר הכח כדי למתוח את השרירים תוך ניטור המשרעת של תגובת העווית עד משרעת העווית מגיעה למקסימום.

13. הקלטות תאיות של תאי עצב אחראים

מנקודה זו ואילך, טכניקות אלקטרו סטנדרטיות משמשות להכנת האלקטרודה תאית, לחדור נוירון בחוט השדרה ולזהות אותו כmotoneuron.

משוך micropipette זכוכית ל~ טיפ 1 מיקרומטר באמצעות פיפטה חולץ (P-97 micropipette פולר, מכשירי סאטר). מלא את האלקטרודה בתמיסת 3M KCl (התנגדות של האלקטרודה 10-20 MΩ).
שימוש micropositioner, לנהוג micropipette, מחובר למגבר תאי (Axoclamp 2B, מכשירי האקסון) לחוט השדרה. פקח את פוטנציאלי השדה המקומיים שהושרו על ידי הגירוי של דוארach עצבים כדי לאתר את הברכה המוטורית של Surae Triceps.
זהירות להתקרב תאי עצב אחראים משוערים תוך ניטור ההתנגדות של microelectrode. כאשר דוחפים נגד קרום, ההתנגדות מגבירה. חדירה מתישהו ניתן להקל באמצעות הפונקציה "הזמזום" של המגבר התאי.

14. נוהל המתת חסד

בתום הניסוי, החיה מורדמת במנת יתר של פנטוברביטל (210 מ"ג / קילו IV), ואחרי עריפת ראש.