使用屏幕在车身尺寸规例中的线虫基因介导的RNA干扰取食策略<em&gt; C.线虫</em

摘要

我们演示了如何使用供给的RNAi技术敲除目标基因和分体尺寸型 C.线虫。这种方法可用于大规模的画面，以找出潜在的基因成分，如在车身尺寸上的DBL-1/TGF-β信号调节。

摘要

双链RNA介导的干扰（RNAi）是一种有效的策略，以击倒靶基因的表达^1-3。它已被应用到许多模型系统，包括植物，无脊椎动物和脊椎动物。有各种各样的方法来实现RNAi 在体内 ^4,5。例如，可以与靶基因的RNAi载体转化，然后永久或瞬时转化的细胞系或初级细胞实现的基因敲除效果，或者从特定的靶基因（RNAi的寡核苷酸）的合成的双链寡核苷酸，可以是瞬时转化靶基因沉默的细胞系或原代细胞或合成的双链RNA分子可显微注射到生物体。由于线虫C.的利用细菌作为食物来源，饲养的动物与对靶基因的表达双链RNA的细菌提供了一个可行的策略。在这里，我们提出的RNAi输送机身尺寸表型的方法来得分。车身尺寸C.线虫主要受型TGF-β -等配位体DBL-1，所以该法是适合识别的TGF-β信号元件^7。我们使用不同的菌株，其中包括两个RNA干扰过敏株重复供给的RNAi实验。我们的研究结果表明，RRF-3株给了我们最好的预期的RNAi表型。该方法易于操作，重现性好，易于量化。此外，我们的协议，最大限度地减少了使用专门的设备，所以它是适合于规模较小的实验室或主要是本科院校。

研究方案

1。准备携带目的基因序列的RNA干扰进料板

1. 如果使用市售的RNAi库（ 例如，从源生物科学生命科学），继续执行步骤1.4。另外，克隆到载体L4440，一种常用的蠕虫RNAi质粒^8的靶基因序列，通过标准的克隆协议。
2. 变换的菌株HT115（DE3）中，用25μg/ ml的羧苄青霉素的LB琼脂平板上培养和12.5微克/毫升四环素的重组质粒转化，并挑选单个克隆，以备将来使用。
3. 同时，转换到菌株HT115使用的实验作为对照的空载体L4440。
4. 文化重组和空L4440携带的细菌在1毫升LB肉汤与100μg/ ml氨苄青霉素过夜，在37°C。四环素还没有添加由于事实，即它减小RNAi效率。
5. 添加另一5毫升隔夜丘尔到100μg/ ml氨苄青霉素的LB肉汤重，另一个孵育4-6小时，在37°C。
6. 种子0.5毫升重组或空L4440携带细菌培养到的RNAi蠕虫板。标记所有板与克隆名称。
7. 马克板孵育过夜，在37℃至生长细菌草坪;这些的RNAi靶基因序列的带或不带板。至少有2块板应为每个条件制备。

2。文化蠕虫的RNAi送料板

1. 火焰消毒，铂丝的尖端蠕虫挑。使用WORM挑来挑去6-10第四幼虫期（L4）雌雄同体每个RNA干扰板，重组或空L4440的动物将使用细菌作为食物来源。
2. 让雌雄同体的增长，在20°C（一个标准的文化条件线虫 ）过夜，他们将成为年轻的成年人的第二天。
3. 6-10青壮年转移到一个新的相应标记，并准备RNA干扰板。
4. 让成人产卵4-6小时，然后取出所有的成年人板，这一步是同步的后代。一旦母亲被删除，开始计时。这是时间为零。
5. 将培养板在20°C，让动物长到特定的发展阶段，在该协议中，我们选择了年轻的成年人表型分析。击倒在一个正常的速度发展，培养72小时是足够的动物成为年轻的成年人。然而，不同的基因影响动物的不同发展。如果RNAi技术使动物生长速度不同，年轻人可以被认定为不超过24小时过去L4完成外阴的发展和2-6胚胎在子宫内（育）。要确定其他发展阶段，研究人员应使用性腺及外阴的发展为导向。

3。分数车身尺寸表型的RNAi治疗的蠕虫

1. 将两层颜色标签磁带在载玻片上。使两个本身载玻片上。然后，将一个新的载玻片上，在两者之间的幻灯片用胶带。熔体在水中的2％琼脂糖;应用一个下拉到中心的新的载玻片上，然后按下顶端的第二玻璃上滑动，使一层薄薄的2％琼脂糖如前所述^9。
2. 琼脂糖凝固后，取出顶部的载玻片上，，琼脂糖凝胶垫的幻灯片已经准备好加载蠕虫。标签幻灯片与克隆名字。
3. 加入10微升25毫米NaN的₃琼脂糖垫;选择30-40动物的NaN ₃解决方案，以固定，然后把盖玻片的顶部，重复重组和空L4440携带的RNA干扰治疗的动物。
4. 在解剖显微镜下的图像的蠕虫使用2.5倍的物镜，这里我们使用徕卡数码相机与支持软件Qcapture的，。
5. 校准，第一次拍摄图像的标准千分尺尺。然后打开图像的Image-Pro软件中，点击“测量”，然后选择“校准”，然后选择“空间校准向导”。随着“校正活动图像”选中，单击“下一步”。输入的名称的校准和确保的空间参考单元被设置到微米。然后，检查“创建参考校准”按钮，然后单击“下一步”。点击“参考线”。会出现一个参考比例尺。重新放置比例尺的千分尺的端部相匹配，则表明参考表示1,000个单位。点击“确定”，“下一步”，“完成”。
6. 一旦软件校准，打开一个蠕虫图像。然后，选择“测量”菜单下，选择“校准”，然后点击“选择空间”。在下拉菜单中，选择创建的文件名千分尺校准。然后，在“测量”菜单中，选择“测量”。在打开的窗口中，选择“自由绘制工具，并通过动物的身体，从头部到尾部与电脑鼠标（ 图1）的中心跟踪线。将在窗口的长度。现在你有两组数据：体长，治疗靶基因的RNAi和处理空L4440矢量的控制动物的动物。
7. 导出到Microsoft Excel文件，或其他合适的统计软件的长度测量。的数据进行分析，通过计算每个样本的平均值和标准偏差。然后比较学生的t检验的样品。

结果

在我们的研究中，我们专注上机身尺寸调节的DBL-1/TGF-β途径。 DBL-1途径体型小，更短的车身长度相比，与野生型动物^7,10,11功能的损失。因此，屏幕为C.线虫的机身尺寸突变体能够确定TGF-β信号组件和改性剂。 DBL-1信号是介导的一个保守的TGF-β的信号转导途径，其中包括细胞表面受体与细胞内的Smad信号传感器^12。要测试的有效性的RNAi通过喂养的车身尺寸突变体的识别，我们?...

讨论

在这个协议中，我们描述的车身尺寸有缺陷的突变体C.识别方法通过RNA干扰喂养的线虫 。此方法是适用于TGF-β信号分量的识别。由于这样的组件通过进化¹⁵是高度保守的，这样的屏幕是在所有后生动物阐明的分子机制的TGF-β信号有关。在这样的屏幕设计是一个重要的考虑出发菌株。我们已经证明，无论ERI-1，LIN-15b和RRF-3更敏感的RNAi喂养比对照菌株，这与以往的研...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
			- RNA干扰蠕虫板 17.7克WORM介质混合 60克琼脂 H 2 O 3升。高压灭菌。 加入3毫升1M IPTG（无菌）和3毫升25毫克/毫升羧苄青霉素（无菌）;然后倒入培养皿60毫米。 蠕虫板 17.7克WORM介质混合 0.6克硫酸链霉素 60克琼脂 H 2 O 3升。高压灭菌。倒成60毫米的培养皿中。 WORM介质混合 的55克Tris-CL 的24克Tris-OH 310克细菌蛋白胨 800毫克胆固醇 200克氯化钠 调匀，一定要避免大块，可以存放许多个月前使用这种粉状混合物。 2％琼脂糖 0.5 G琼脂糖 广告D 25毫升蒸馏水2 O。在微波加热，直至溶解。 1M异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导 2克IPTG 毫升蒸馏水溶解IN10 2 O 1M NaN的3 6.5克楠3 添加蒸馏水至100毫升2 O 25毫米楠3 2.5毫升1M南3 添加蒸馏水至100毫升2 O 秀丽隐杆线虫线虫遗传学中心 L4440质粒（携带氨苄青霉素抗性基因） 细菌菌株HT115（DE3）中（包含经IPTG诱导T7聚合酶; RNA酶III基因（dsRNAse）也携带四环素抗性基因的缺陷）16 60毫米陪替氏培养皿 100毫米培养皿 14毫升的园底猎鹰文化管 玻璃幻灯片 盖玻片 1-20微升移液器 20-200微升移液器 200-1000微升移液器 1-200μL枪头 200-1000微升枪头 1.5毫升的Eppendorf管 铂丝蠕虫挑