El uso de ARN de interferencia mediada estrategia de alimentación para la detección de genes implicados en la regulación del cuerpo Tamaño del nematodo<em&gt; C. elegans</em

Resumen

Se demuestra cómo utilizar la técnica de alimentación RNAi para derribar los genes diana y el fenotipo puntuación en el tamaño del cuerpo C. elegans. Este método podría ser utilizado para una pantalla de gran escala para identificar los posibles componentes genéticos de interés, tales como los implicados en la regulación del tamaño del cuerpo por la señalización de DBL-1/TGF-β.

Resumen

Haga doble cadena de ARN mediada por interferencia (ARNi) es una estrategia efectiva para derribar objetivo de la expresión génica ^1-3. Se ha aplicado a muchos sistemas modelo incluyendo plantas, invertebrados y vertebrados. Hay varios métodos para lograr la RNAi in vivo ^4,5. Por ejemplo, el gen diana puede ser transformado en un vector de ARNi, y a continuación, ya sea permanentemente o transitoriamente transformado en líneas celulares o células primarias para lograr los efectos de genes desmontables; alternativamente sintetizarse oligonucleótidos de doble cadena a partir de genes diana específicos (RNAi oligos) puede ser transitoriamente transformado en líneas celulares o células primarias de silenciar genes diana, o sintetizado de doble filamento moléculas de ARN puede microinyectarse en un organismo. Desde el nematodo C. elegans utiliza bacterias como fuente de alimento, la alimentación de los animales con bacterias que expresan ARN de cadena doble contra genes diana proporciona una estrategia viable ^6. A continuación les presentamos una alimentación RNAimétodo de anotar el tamaño del cuerpo fenotipo. Tamaño del cuerpo en C. elegans está regulada principalmente por el TGF-β - ligando como DBL-1, por lo que este método es apropiado para la identificación de TGF-β componentes de señalización ^7. Utilizamos diferentes cepas incluyendo dos cepas RNAi hipersensibilidad a repetir los experimentos de alimentación RNAi. Nuestros resultados mostraron que la FRR-3 cepa nos dio el mejor esperada fenotipo RNAi. El método es fácil de realizar, reproducible, y se cuantifica fácilmente. Por otra parte, el protocolo minimiza el uso de equipo especializado, por lo que es adecuado para laboratorios pequeños o aquellos en instituciones predominantemente de licenciatura.

Protocolo

1. Preparación de las placas de RNAi de alimentación que llevan la secuencia del gen diana

1. Si se utilizan las bibliotecas RNAi disponibles comercialmente (por ejemplo, de LifeSciences Fuente BioScience), vaya al paso 1.4. Alternativamente, clonar secuencias de genes diana en el vector L4440, un gusano utiliza comúnmente RNAi plásmido ^8, por el protocolo de clonación.
2. Transformar el plásmido recombinante en la cepa bacteriana HT115 (DE3), cultivarlas en placas de agar LB con 25 mg / ml de carbenicilina y 12,5 mg / ml de tetraciclina, y recoger un solo clon para su uso futuro.
3. Mientras tanto, transformar el vector vacío L4440 en la cepa bacteriana HT115 para utilizar como un control para los experimentos.
4. Cultura tanto recombinantes como vacío L4440 portadoras de bacterias en 1 ml de caldo LB con 100 ug / ml de ampicilina durante la noche a 37 ° C. La tetraciclina no se añade debido al hecho de que disminuye la eficiencia de RNAi.
5. Añadir otra caldo de 5 ml de LB con 100 mg / ml de ampicilina durante la noche en el culre, incubar durante 4-6 horas otro a 37 ° C.
6. Seed 0,5 ml recombinante o vacío L4440 transporte de cultivo bacteriano en las placas de gusanos RNAi. Marque todas las placas con el nombre de clon.
7. Marcar las placas y se incuban durante la noche a 37 ° C para crecer césped bacteriano, que son las placas de RNAi con o sin la secuencia del gen objetivo. Al menos 2 placas deben estar preparados para cada condición.

2. Worms Cultura en las placas de alimentación RNAi

1. Conviene esterilizar la punta de un pico de platino gusano de alambre. Utilice el gusano de selección para escoger 6-10 cuarta etapa larvaria (L4) hermafroditas a cada placa de ARNi que contiene ya sea recombinante o vacío L4440; los animales se utilizan las bacterias como fuente de alimento.
2. Vamos hermafroditas crecer a 20 ° C (una condición de cultivo estándar para C. elegans) durante la noche, se convertirán en adultos jóvenes el día siguiente.
3. Traslado 6-10 adultos jóvenes en un nuevo debidamente etiquetado y preparado placa RNAi.
4. Deje que eladultos ponen huevos durante 4-6 horas, a continuación, retire todos los adultos de la placa; este paso es sincronizar la progenie. Una vez que las madres se retiran, empieza a contar el tiempo. Este es el tiempo cero.
5. Las placas se incuban a 20 ° C para permitir que los animales crezcan a la etapa de desarrollo específico, en este protocolo, elegimos los adultos jóvenes para el análisis fenotípico. Para los derribos que se desarrollan a un ritmo normal, de 72 horas de incubación es suficiente para que los animales se convierten en adultos jóvenes. Sin embargo, varios genes afectan el desarrollo animal diferente. Si RNAi hace que los animales crezcan a un ritmo diferente, los adultos jóvenes pueden ser identificados como aquellos hr no más de 24 L4 pasado con el desarrollo completado vulvar y embriones de 2-6 en el útero (si es fértil). Para identificar otras etapas de desarrollo, el investigador debe utilizar el desarrollo gonadal y la vulva como guía.

3. Puntuación Fenotipos tamaño corporal de RNAi tratada Worms

1. Colocar dos capas de cintas de etiquetas de colores sobre un portaobjetos de vidrio. Haz dos de lassE diapositivas de vidrio. A continuación, colocar un portaobjetos de vidrio nuevo entre los dos portaobjetos con cinta. Derretir 2% de agarosa en agua, aplicar una gota en el centro de la placa de vidrio nuevo, a continuación pulse el portaobjetos de vidrio segundos en la parte superior para formar una capa delgada de agarosa al 2% como se ha descrito anteriormente ^9.
2. Una vez que se ha solidificado de agarosa, retire la placa de vidrio superior, el portaobjetos con agarosa almohadilla está listo para cargar gusanos. Etiqueta de la diapositiva con el nombre de clon.
3. Añadir 10 l 25 mM NaN ₃ a la plataforma de agarosa; recoger animales 30-40 en el NaN ₃ solución para inmovilizarlos, a continuación, poner el cubreobjetos en la parte superior, repetir, tanto recombinantes y vacío L4440 transporte de RNAi animales tratados.
4. Imagen de los gusanos bajo microscopio de disección con lente objetivo 2.5x, aquí usamos Leica cámara digital con soporte Qcapture software.
5. Para la calibración, primero capturar una imagen de una regla micrómetro estándar. A continuación, abra la imagen en Image-Pro software, haga clic en "medida" y seleccione "Calibración" y elija"Asistente de calibración espacial". Con "calibrar la imagen activa" seleccionado, haga clic en "Siguiente". Ingrese el nombre para la calibración y asegúrese de que las unidades de referencia espacial se ponen a micrómetro. A continuación, marque la casilla "crear una calibración de referencia" y haga clic en "Siguiente". Haga clic en "línea de referencia empate". Una barra de escala de referencia aparecerá. Cambiar la posición de la barra de escala para coincidir con los extremos del micrómetro, a continuación, indican que la referencia indica 1.000 unidades. Haga clic en "Aceptar", "Siguiente" y "Finalizar".
6. Una vez que el software está calibrado, abrir una imagen de gusano. A continuación, seleccione en la "medida" del menú, seleccione "Calibración" y haga clic en "select espacial". En el menú desplegable, seleccione el nombre del archivo creado para la calibración de micrómetros. A continuación, en la "medida" del menú, seleccione "mediciones". En la ventana que se abre, seleccione la herramienta libre de dibujar y trazar una línea que pasa por el centro del cuerpo del animal, de la cabeza a la cola con el ratón del ordenador (Figura 1). La longitud se muestran en la ventana. Ahoradispone de dos grupos de datos: longitud corporal de los animales tratados con genes objetivo RNAi y control de los animales tratados con vacío L4440 vector.
7. Exportar las mediciones de longitud en un archivo de Microsoft Excel, u otro software estadístico adecuado. Analizar los datos calculando la desviación media y estándar para cada muestra. Luego compare las muestras mediante la t de Student prueba.

Resultados

En nuestra investigación, nos centramos en el tamaño corporal regulación por la vía DBL-1/TGF-β. La pérdida de función de los resultados vía DBL-1 en el tamaño corporal pequeño, como una longitud de cuerpo más corto en comparación con el de tipo salvaje animales ^7,10,11. Así, las pantallas de C. elegans mutantes tamaño del cuerpo son capaces de identificar TGF-β componentes de señalización y modificadores. DBL-1 de señalización está mediada por una conservadas TGF-β vía de trans...

Discusión

En este protocolo, describimos nuestro método para la identificación de mutantes defectuosos tamaño corporal de C. elegans por alimentación RNAi. Este método es aplicable a la identificación de los componentes de señalización de TGF-β. Puesto que tales componentes están altamente conservadas a través de la evolución ^15, tales pantallas son relevantes para elucidar los mecanismos moleculares de la señalización de TGF-β en todos los metazoos. Una consideración importante en el diseño d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
			RNAi placas gusano 17,7 g Gusano Media Mix 60 g Agar Añadir H 2 O a 3 litros. Autoclave. Añadir 3 ml de 1 M de IPTG (estéril) y 3 ml de 25 mg / ml de carbenicilina (estéril); después se vierte en 60 mm placas de Petri. Placas Gusano 17,7 g Gusano Media Mix 0,6 g de sulfato de estreptomicina 60 g Agar Añadir H 2 O a 3 litros. Autoclave. Vierta la mezcla en 60 mm placas de Petri. Gusano Mix Media 55 g de Tris-Cl 24 g de Tris-OH 310 g de Bacto peptona 800 mg Colesterol 200 g de NaCl Mezclar bien y asegúrese de evitar pedazos, lo mezcla en polvo puede ser almacenado durante muchos meses antes de su uso. 2% de agarosa 0,5 g de agarosa Anunciod 25 ml dH 2 O. Calentar en el microondas hasta que se disuelve. 1M isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 2 g IPTG Disolver in10 ml dH 2 O 1M NaN 3 6,5 g de NaN3 Añadir dH 2 O y 100 ml 25 mM NaN 3 2,5 ml de 1M NaN 3 Añadir dH 2 O y 100 ml Caenorhabditis elegans de Caenorhabditis Centro de Genética Plásmido L4440 (lleva resistencia a ampicilina gen) Las bacterias cepa HT115 (DE3) (contiene inducible por IPTG polimerasa T7; deficiente para la RNasa III gen (un dsRNAse) que también lleva el gen de resistencia a tetraciclina) 16 60 mm Placas de Petri 100 mm placas de Petri 14 ml de fondo redondo Falcon tubos de cultivo portaobjetos de vidrio cubreobjetos de vidrio 1-20 pipeta l 20-200 l pipeta 200-1000 lpipeta Puntas de pipeta 1-200 mu l 200-1000 puntas de pipeta mu l 1,5 ml tubos Eppendorf alambre de platino gusano selección