En utilisant l&#39;ARN médiée par la stratégie d&#39;alimentation interférences à l&#39;écran pour des gènes impliqués dans le règlement de la taille du corps du nématode<em&gt; C. elegans</em

Résumé

Nous montrons comment utiliser la technique d'alimentation ARNi pour abattre gènes cibles et le phénotype taille score de corps C. elegans. Cette méthode pourrait être utilisée pour un écran à grande échelle pour identifier les éventuels composants génétiques d'intérêt, tels que ceux qui sont impliqués dans la régulation de la taille du corps par la signalisation DBL-1/TGF-β.

Résumé

Double-brin d'ARN médiée par interférence (ARNi) est une stratégie efficace pour faire tomber l'expression du gène cible ^1-3. Il a été appliqué à de nombreux systèmes modèles, y compris les plantes, les invertébrés et les vertébrés. Il existe différentes méthodes pour atteindre ^4,5 ARNi in vivo. Par exemple, le gène cible peut être transformé en un vecteur d'ARNi, puis de façon permanente ou transitoire transformé dans des lignées cellulaires ou des cellules primaires pour obtenir des effets inactivation génique; bien synthétisées oligonucléotides double brin de gènes cibles spécifiques (ARNi oligos) peut être transitoirement dans des lignées cellulaires transformées ou des cellules primaires pour réduire au silence des gènes cibles, ou double-brin synthétisé les molécules d'ARN peuvent être micro-injectées dans l'organisme. Depuis le nématode C. elegans utilise des bactéries comme source de nourriture, nourrir les animaux avec des bactéries exprimant double-brin d'ARN contre les gènes cibles fournit une stratégie viable ^6. Nous présentons ici une alimentation ARNiméthode pour marquer phénotype taille du corps. Taille du corps chez C. elegans est régulée principalement par le TGF-β - ligand comme DBL-1, si ce test est approprié pour l'identification du TGF-β composants de signalisation ^7. Nous avons utilisé différentes souches dont deux souches ARNi hypersensibles à répéter les expériences d'alimentation ARNi. Nos résultats ont montré que far-3 souche nous a donné le meilleur phénotype attendu ARNi. La méthode est facile à réaliser, reproductible et facilement quantifiables. En outre, notre protocole minimise l'utilisation de l'équipement spécialisé, il est donc approprié pour les petits laboratoires ou les établissements majoritairement de premier cycle.

Protocole

1. Préparation des plaques d'alimentation ARNi séquence porteuse gène cible

1. Si vous utilisez les bibliothèques disponibles dans le commerce ARNi (par exemple à partir de LifeSciences Source BioScience), passez à l'étape 1.4. Alternativement, cloner des séquences de gènes cibles dans le vecteur L4440, un ver couramment utilisé ARNi plasmide ^8, par protocole de clonage standard.
2. Transformer le plasmide recombinant dans la souche bactérienne HT115 (DE3), la culture sur les plaques d'agar LB avec 25 ug / ml de carbénicilline et 12,5 pg / ml tétracycline, et de choisir un seul clone pour une utilisation future.
3. Pendant ce temps, transformer le L4440 vecteur vide dans la souche bactérienne HT115 pour l'utiliser comme une commande pour les expériences.
4. Culture fois recombinants et vide L4440-porteurs de bactéries dans 1 ml de bouillon LB avec 100 pg / ml d'ampicilline pendant la nuit à 37 ° C. Tétracycline n'est pas ajouté en raison du fait qu'elle réduit l'efficacité ARNi.
5. Ajouter un autre bouillon de 5 LB ml avec 100 pg / ml d'ampicilline dans la nuit culture, incuber pendant une autre heure 6.4 à 37 ° C.
6. Seed 0,5 ml recombinant ou vide L4440-portant culture bactérienne sur les plaques à vis sans fin ARNi. Étiquetez toutes les plaques avec le nom de clone.
7. Marquer les plaques et incuber pendant une nuit à 37 ° C pour augmenter tapis bactérien, ce sont les plaques d'ARNi avec ou sans séquence de gène cible. Au moins 2 plaques doivent être préparés pour chaque condition.

2. Worms Culture sur les plaques d'alimentation ARNi

1. Flamme stériliser la pointe d'un pick ver fil de platine. Utilisez le ver choisir de prendre 6-10 quatrième stade larvaire (L4) hermaphrodites à chaque plaque ARNi qui contient soit L4440 recombinant ou vides, les animaux utilisent les bactéries comme source de nourriture.
2. Laissez hermaphrodites croître à 20 ° C (une des conditions de culture standard pour C. elegans) pendant la nuit, ils deviennent de jeunes adultes le lendemain.
3. Transfert 6-10 jeunes adultes dans une nouvelle plaque ARNi en conséquence étiquetés et prêts.
4. Laissez leadultes pondent des œufs pour 4-6 heures, puis supprimez tous les adultes à partir de la plaque; cette étape consiste à synchroniser la descendance. Une fois que les mères sont enlevées, commencez à compter le temps. C'est le temps zéro.
5. Incuber les plaques à 20 ° C pour permettre aux animaux grandissent au stade de développement spécifique, dans ce protocole, nous choisissons les jeunes adultes pour l'analyse phénotypique. Pour passes rabattues qui se développent à un rythme normal, 72 heures d'incubation est suffisante pour que les animaux deviennent de jeunes adultes. Cependant, différents gènes influent sur le développement des animaux différemment. Si RNAi entraîne les animaux à se développer à un rythme différent, les jeunes adultes peuvent être identifiés comme étant ceux h pas plus de 24 L4 passé avec le développement vulvaire complété et 2-6 embryons dans l'utérus (si fertile). Pour identifier d'autres stades de développement, l'enquêteur doit utiliser le développement des gonades et de la vulve comme un guide.

3. Phénotypes note d'état corporel Taille de l'ARNi traité de Worms

1. Placez deux couches de rubans d'étiquettes colorées sur une lame de verre. Assurez-deux deslames de verre soi. Puis, placer une lame de verre à nouveau entre les deux lames de ruban. Faire fondre agarose à 2% dans l'eau, appliquer une goutte au centre de la lame de verre nouveau, puis appuyez sur la lame de verre deuxième sur le dessus pour faire une fine couche de 2% d'agarose comme décrit précédemment ^9.
2. Une fois que l'agarose est solidifié, retirer la lame de verre haut, la lame d'agarose pad est prêt à charger vers. Glissière étiquette avec le nom de clone.
3. Ajouter 10 ul 25 mm ₃ NaN pour le pad agarose; prendre 30-40 individus dans la solution _de NaN3 de les immobiliser, puis mettre la lamelle sur le dessus; répétez l'opération pour les deux recombinante et vide L4440-portant RNAi chez les animaux traités.
4. L'image des vers sous loupe binoculaire à l'aide objectif 2.5x, ici nous utilisons Leica appareil photo numérique avec l'appui Qcapture logiciel.
5. Pour l'étalonnage, d'abord capturer une image d'un souverain micromètre standard. Ensuite, ouvrez l'image dans l'image-Pro, Cliquez sur "mesure" et choisissez "étalonnage", puis choisissez«Assistant de calibrage spatial». Avec «calibrer l'image active" est sélectionné, cliquez sur "suivant". Saisissez le nom de l'étalonnage et de veiller à ce que les unités de référence spatiale sont mis à micromètre. Ensuite, cochez la case "créer un étalonnage de référence" et cliquez sur "Suivant". Cliquez sur "ligne de référence tirage au sort." Un bar échelle de référence apparaît. Repositionner la barre d'échelle pour faire correspondre les extrémités du micromètre, puis d'indiquer que la référence indique 1.000 unités. Cliquez sur "OK", "Suivant" et "Terminer".
6. Une fois que le logiciel est calibré, ouvrez une image ver. Ensuite, sélectionnez dans la "mesure", sélectionnez "calibration" puis cliquez sur "select spatiale". Dans le menu déroulant, sélectionnez le nom du fichier créé pour l'étalonnage du micromètre. Puis, sous la "mesure", sélectionnez "mesures". Dans la fenêtre qui s'ouvre, sélectionnez l'outil à dessiner et tracer une ligne passant par le centre du corps de l'animal, de la tête à la queue avec la souris d'ordinateur (Figure 1). La longueur sera signalée dans la fenêtre. Maintenantvous avez deux groupes de données: la longueur du corps des animaux traités par ARNi des gènes cibles et les animaux témoins traités avec vide L4440 vecteur.
7. Exportez les mesures de longueur dans un fichier Microsoft Excel ou d'autres logiciels de statistique appropriée. Analyser les données en calculant la moyenne et l'écart-type pour chaque échantillon. Puis comparer les échantillons à l'aide de Student t-test.

Résultats

Dans notre recherche, nous nous concentrons sur la réglementation taille du corps par la voie DBL-1/TGF-β. La perte de fonction des résultats voie DBL-1 dans une petite taille, y compris une longueur plus courte du corps par rapport à des animaux de type sauvage ^7,10,11. Ainsi, écrans pour C. elegans mutants taille du corps sont capables d'identifier les composants de signalisation TGF-β et de modificateurs. DBL-1 signalisation est médiée par une conservée TGF-β voie de transduction de ...

Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons notre méthode pour l'identification des mutants défectueux de la taille du corps C. elegans par l'alimentation ARNi. Cette méthode est applicable à l'identification des composants de signalisation du TGF-β. Depuis ces composants sont hautement conservées à travers l'évolution ^15, ces écrans sont pertinents pour élucider les mécanismes moléculaires de la signalisation du TGF-β dans tous les métazoaires. Une considération importante dans...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Plaques à vis sans fin ARNi 17,7 g Mélanger moyen Worm 60 g Agar Ajouter H 2 O à 3 litres. Autoclave. Ajouter 3 ml d'IPTG 1M (stérile) et 3 ml 25 mg / ml carbénicilline (stérile), puis verser dans des boîtes de 60 mm de Pétri. Plaques à vis sans fin 17,7 g Mélanger moyen Worm 0,6 g de sulfate de streptomycine 60 g Agar Ajouter H 2 O à 3 litres. Autoclave. Verser dans 60 boîtes de Pétri mm. Mix Moyen Worm 55 g de Tris-Cl 24 g de Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg de cholestérol 200 g de NaCl Mélanger soigneusement et veillez à éviter les morceaux, ce mélange en poudre peut être conservée pendant de nombreux mois avant de les utiliser. Agarose à 2% 0,5 g d'agarose Annonced 25 ml dH 2 O. La chaleur au micro-ondes jusqu'à dissolution. 1M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissoudre in10 ml dH 2 O 1M NaN 3 6,5 g de NaN3 Ajouter dH 2 O à 100 ml 25 mM NaN 3 2,5 ml 1M NaN 3 Ajouter dH 2 O à 100 ml Caenorhabditis elegans de Caenorhabditis du Genetics Center L4440 plasmide (porte résistance à l'ampicilline gène) Souche de bactéries HT115 (DE3) (contient IPTG polymérase T7 inductible; déficient pour la RNAse III gène (dsRNase) qui porte également la tétracycline gène de résistance) 16 60 mm boîtes de Pétri 100 mm boîtes de Pétri 14 ml à fond rond tubes de culture Falcon lames de verre lamelles de verre 1-20 pipette ul 20-200 ul pipette 200-1000 ulpipette 1-200 embouts de pipette ul 200-1000 embouts de pipette ul Tubes Eppendorf de 1,5 ml choix ver fil de platine