Использование РНК-опосредованного вмешательства стратегии кормления для выявления генов, участвующих в размерах тела регулированию в Нематода<em&gt; C. Элеганс</em

Резюме

Мы продемонстрируем, как использовать технику RNAi кормления, чтобы сбить генов-мишеней и оценка размеров тела фенотип C. Элеганс. Этот метод может быть использован для большого экрана масштаба для выявления потенциальных генетических компонентов интереса, таких как тех, кто участвует в размерах тела регулирования DBL-1/TGF-β сигнализации.

Аннотация

Двухцепочечной РНК-опосредованного вмешательства (RNAi) является эффективной стратегией, чтобы сбить цель экспрессии гена ^1-3. Это была применена для многих модельных систем, включая растения, беспозвоночных и позвоночных животных. Существуют различные методы для достижения RNAi в естественных ^4,5. Например, ген-мишень может быть преобразована в векторе RNAi, а затем постоянно или временно превращаются в клеточные линии, или первичные элементы для достижения эффекта гена нокдаун, можно также синтезировать двунитевых олигонуклеотидов от специфических генов-мишеней (RNAi олигонуклеотиды) может быть временно превращаются в клеточные линии или первичные клетки, чтобы заставить замолчать гены-мишени, или синтезированные двухцепочечной молекулы РНК могут быть микроинъекции в организм. Так как нематоды C. Элеганс используется бактериями как источник пищи, кормление животных с бактериями, выразив двухцепочечной РНК против генов-мишеней обеспечивает жизнеспособную стратегию ^6. Здесь мы представляем кормления RNAiМетод забить фенотип размера тела. Размер тела в C. Элеганс регулируется, прежде всего, TGF-β - как лиганд DBL-1, так что этот тест подходит для идентификации TGF-β сигнализации компоненты ^7. Мы использовали различные штаммы в том числе два RNAi гиперчувствительной штаммов, чтобы повторить эксперименты RNAi кормления. Наши результаты показали, что СБР-3 штамма дали нам лучшее ожидаемый фенотип RNAi. Метод прост для выполнения, воспроизводимые и легко поддаются количественной оценке. Кроме того, наш протокол сводит к минимуму использование специализированного оборудования, поэтому она подходит для небольших лабораторий или те, в основном студентов учреждений.

протокол

1. Подготовка RNAi кормления Плиты Проведение последовательности гена-мишени

1. При использовании коммерчески доступных RNAi библиотеки (например, от источника BioScience Lifesciences), переходите к шагу 1.4. Кроме того, клонирование последовательности целевого гена в вектор L4440, обычно используемые червем RNAi плазмиды ^8, по стандартному протоколу клонирования.
2. Преобразование рекомбинантной плазмиды в бактериальном штамме HT115 (DE3), культуру их на пластинах LB агар с 25 мкг / мл карбенициллин и 12,5 мкг / мл тетрациклина, и выбрать одного клона для использования в будущем.
3. Между тем, преобразовать пустые L4440 вектор в бактериальном штамме HT115 для использования в качестве контроля для экспериментов.
4. Культура и рекомбинантные и пустые L4440 несущих бактерий в 1 мл бульона LB с 100 мкг / мл ампициллина в течение ночи при 37 ° C. Тетрациклин не добавил в связи с тем, что она снижает эффективность РНК-интерференции.
5. Добавить еще 5 мл LB бульоне с 100 мкг / мл ампициллина в ночь cultuповторно, инкубировать в течение еще 4-6 ч при 37 ° C.
6. Семенной 0,5 мл рекомбинантного или пустой L4440 несущих бактериальной культуры на пластинах RNAi червей. Этикетка все пластины с клоном имя.
7. Отметить пластины и инкубировать в течение ночи при 37 ° C рост бактериальных газонов; эти RNAi пластины с или без целевой последовательности гена. По крайней мере, 2 пластины должны быть подготовлены для каждого условия.

2. Культура червей на пластинах RNAi кормления

1. Пламя стерилизации кончик червя выбор платиновой проволоки. Используйте червя выбрать, чтобы подобрать 6-10 четвёртую личиночной стадии (L4) гермафродиты на каждой пластине РНК-интерференции, который содержит либо рекомбинантные или пустой L4440, животные будут использовать бактерии в качестве источника пищи.
2. Пусть гермафродиты расти при 20 ° C (стандартное условие культуры C. Элеганс) в течение ночи, они станут молодые люди на следующий день.
3. Передача 6-10 молодых людей в новую соответственно промаркированы и подготовлены пластины RNAi.
4. ПустьВзрослые откладывают яйца в течение 4-6 ч, затем удалить все взрослые от пластины; этот шаг, чтобы синхронизировать потомства. Как только матерям будут удалены, начинают отсчитывать время. Это время нуля.
5. Инкубируйте пластины при температуре 20 ° C, чтобы животные растут конкретные стадии развития, и в этом протоколе, мы выбираем молодых людей для фенотипического анализа. Для нокдаунов, которые развиваются на нормальной скорости, 72 ч инкубации является достаточным для животных, чтобы стать молодые люди. Тем не менее, различные гены влияют на развитие животных по-разному. Если RNAi вызывает животные расти с разной скоростью, молодые люди могут быть определены как те, не более 24 часов с прошлым L4 завершена разработка и вульвы 2-6 эмбрионов в матку (если плодородный). Для выявления других стадиях развития, следователь должен использовать половых и вульвы развития в качестве ориентира.

3. Оценка Размер тела Фенотипы RNAi Обработанные черви

1. Поместите два слоя цветного ленты этикетки на стекле. Сделайте дваслайды себе стекло. Затем поместите новое предметное стекло между двумя слайдами с лентой. Растопить 2% агарозном в воде; применять одну каплю в центре нового предметное стекло, а затем нажмите вторую предметное стекло на верхней, чтобы сделать тонким слоем 2% агарозном как описано выше ^9.
2. После агарозном затвердевает, снимите верхнюю предметное стекло, стекло с агарозном площадка готова для загрузки червей. Этикетка слайд с названием клон.
3. Добавить 10 мкл 25 мМ NaN ₃ в агарозном площадку, возьмите 30-40 животных в NaN ₃ решения, чтобы обездвижить их, затем положить покровное на вершине; повтора как для рекомбинантного и пустые L4440 несущих RNAi-обработанных животных.
4. Изображение червей под рассекает микроскопом, используя 2.5x объектив, здесь мы используем Leica цифровой камеры с поддержкой программного обеспечения Qcapture.
5. Для калибровки, в первую захвата изображения стандартной линейки микрометра. Затем откройте изображение в Image-Pro программного обеспечения, нажмите на "мера" и выберите "калибровка" выберите"Пространственной мастер калибровки". С "Калибровка активного образа" выбраны, нажмите на кнопку "Далее". Введите имя для калибровки и убедиться, что пространственные единицы ссылкой установлены на микрометр. Затем проверьте, "создать ссылку калибровка" и нажмите кнопку "Далее". Нажмите на "опорной линии ничья". Бар ссылкой шкале появится. Переместите шкалы в соответствии с концами микрометр, то указать, что ссылка указывает 1000 единиц. Нажмите "OK", "Next" и "Finish".
6. После того как программа откалибровать, открыть червь изображения. Затем выберите в соответствии с "мерой" меню выберите пункт "калибровка", а затем нажмите на кнопку "Выбрать пространственные". В выпадающем меню выберите имя файла создается для калибровки микрометров. Затем, в соответствии с "мерой" меню выберите пункт "измерений". В открывшемся окне выберите свободно рисовать инструментом и проследить линию через центр тела животного от головы до хвоста с компьютерной мыши (рис. 1). Длина будут представлены в окне. Сейчасу вас есть две группы данных: длина тела животных, получавших целевого гена РНК-интерференции и контроля животных, получавших с пустыми L4440 вектор.
7. Экспорт измерения длины в файл Microsoft Excel или другого подходящего статистического программного обеспечения. Анализ данных путем вычисления среднего значения и стандартного отклонения для каждого образца. Затем сравнить образцы с использованием Стьюдента-тест.

Результаты

В нашем исследовании мы ориентируемся на размер тела регулирования DBL-1/TGF-β пути. Потеря функции DBL-1 путей приводит к небольшим размером тела, в том числе короче длины тела по сравнению с диким типом животных ^7,10,11. Таким образом, экраны для C. Элеганс мутантов размером тела спос?...

Обсуждение

В этом протоколе, мы описываем наш метод для определения размера тела дефектных мутантов C. Элеганс от кормления RNAi. Этот метод применим для выявления TGF-β компоненты сигнализации. Поскольку такие компоненты высоко консервативны в процессе эволюции ^15, такие экраны имеют отно?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Пластинами RNAi червей 17,7 г Worm средний Mix 60 г агара Добавить H 2 O до 3 литров. Автоклав. Добавьте 3 мл 1М IPTG (стерильная) и 3 мл 25 мг / мл Карбенициллин (стерильная), а затем вылейте в 60 мм чашки Петри. Червь пластины 17,7 г Worm средний Mix 0,6 г стрептомицина сульфат 60 г агара Добавить H 2 O до 3 литров. Автоклав. Налейте в 60 мм чашки Петри. Mix Worm Средний 55 г Трис-Cl 24 г Трис-OH 310 г Bacto Пептон 800 мг холестерина 200 г NaCl Тщательно перемешайте и обязательно, чтобы избежать куски, это порошкообразную смесь можно хранить в течение многих месяцев до начала использования. 2% агарозном 0,5 г агарозы ОбъявлениеD 25 мл дН 2 O. Тепло в микроволновой печи до полного растворения. 1M изопропиловый β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) 2 г IPTG Растворите in10 мл дН 2 O 1M NaN 3 6,5 г NaN 3 Добавить дН 2 O в 100 мл 25 мМ NaN 3 2,5 мл 1М NaN 3 Добавить дН 2 O в 100 мл Caenorhabditis Элеганс от Caenorhabditis генетический центр L4440 плазмиды (ампициллин несет ген устойчивости) Бактерии напрягать HT115 (DE3) (содержит IPTG индуцибельной T7-полимеразы; недостаточно для РНКазы III гена (dsRNAse), которая также осуществляет тетрациклину ген устойчивости) 16 60 мм чашки Петри 100 мм чашки Петри 14 мл с круглым дном трубы Сокол культуры стеклах покровные стекла 1-20 мкл пипетки 20-200 мкл пипетки 200-1000 мклпипетки 1-200 мкл советы пипетки 200-1000 мкл советы пипетки 1,5 мл Eppendorf трубы платиновой проволоки червя выбор