等距和骨骼肌产生偏心力评估隔离肌营养不良症的小鼠模型

摘要

肌肉功能的测量有助于肌肉病理评价的潜在疗法，以及测定这种组织生理学机制。我们将展示准备的伸趾长肌和膈肌功能测试。协议将显示为等长收缩和离心收缩，以及营养不良肌肉之间的业绩差异的一种病理状态，和野生的肌肉。

摘要

肌肉疾病的潜在疗法的评价是敏感的和可重复的生理评估肌肉功能。由于许多临床前试验，依靠这些疾病的小鼠模型，已成为孤立的肌肉功能的Go / NoGo决定的候选药物进入患者的标准之一。趾长伸肌（EDL）和膈肌功能测试，这是主要的肌肉利用这些研究，我们将展示准备。 EDL肌肉的几何形状是非常孤立的肌肉，有两个方便的筋，具有体积小，可以支持灌流在洗澡。的隔膜具有深刻的进步的病理，在营养不良的动物，可以作为一个平台，打击纤维化评估很多潜在的治疗，并促进肌纤维的稳定性。协议的例行试验，包括等距和偏心TRIC收缩，将被显示。等长收缩力的力量，提供评估和离心收缩，有助于评估肌膜稳定，这是打乱了多种类型的肌营养不良症。从野生型和营养不良的肌肉肌肉的预期结果之间的比较，也可提供。这些措施可以补充的形态和生化测定组织的平衡，以及整个动物的肌肉功能的评估。

引言

肌肉功能的测量有助于评价潜在治疗肌肉病理，以及测定这种组织生理学机制。对于肌肉疾病，使用的小鼠模型已成为一个重要组成部分，为了解基因型和表型之间的联系，以及扩展知识转化为设计和测试的潜在疗法。肌营养不良症，尤其是依赖于小鼠，以评估这些代理商和建立的临床前数据，需要向前移动到患者的试验中。一个常见的​​测量结果使用孤立的肌肉功能来决定力量，这是适用于广泛的研究。另一项措施是利用偏心，或延长，收缩，以确定肌细胞膜的完整性，这是缺乏在杜氏肌营养不良症，这种疾病的小鼠模型（MDX）。因此，至关重要的是，这些类型的measurem已废除，灵敏度高，重现。

鼠标趾长伸肌（EDL）肌肉已被广泛使用，为孤立的肌肉功能，由于其理想的几何形状和大小，均匀的纤维取向和明确的肌腱^{，2，5，6，10，12。} EDL肌肉等角功能测量的方法中已经描述的前一JOVE刊物^8，以及在对待NMD的SOP ^1。我们扩大了这些方法的描述，包括等长收缩和离心收缩。 EDL，包括heighted退化/再生周期，并减少力输出的疾病的标志是很明显的。

鼠标隔膜具有最快速的肌肉萎缩症的病理发展相比其他肌肉鼠标^11。按6月龄中，累积纤维化包括约50％的肌肉。这将导致在显著impaire研发力量输出^11。因此，可以防止纤维化浸润的治疗剂可以在膜片有效地进行评估。

的抗肌萎缩蛋白的肌肉损失，导致脆性增加和提高收缩所有肌肉损伤^9。因此，许多杜氏进行性肌营养不良症的治疗都是为了更换为抗肌萎缩蛋白。因此，分析，评估这些战略已成为必不可少的离心收缩，它可以区分正常和营养不良的肌肉，以及确定什么好处一种特定的战略保护营养不良的肌肉收缩损坏^{2，3，4， 12。}此过程需要一个双模式的伺服电机，可以调制/记录长度和力，或迅速分开的力换能器的方法的调整长度。

研究方案

所有的程序进行了审查和批准由美国宾夕法尼亚IACUC大学。

1。 EDL的剖析和准备（约30分钟）

1. 麻醉小鼠，以确保他们的经验在手术过程中没有疼痛或痛苦，但肌肉保持含氧的血液循环。我们经常使用氯胺酮/甲苯​​噻嗪通过IP鸡尾酒（100/10毫克/公斤）注射。手术的麻醉是由完全没有的踏板或palpedral的戒断反应能力，或缺乏的耳朵抽搐反应。
2. 固定用医用胶带的后肢，并去除皮肤低级前后肢暴露这个区域的肌肉。保持肌肉湿润以规则的时间间隔与该应用程序的PBS。
3. 在解剖的范围，作一小切口，以揭露的EDL肌肌腱近端外侧，膝盖。在该地区有两条肌腱，双方应削减到重新的EDL的moval。
4. 在脚踝内侧，切的TA肌肉肌腱暴露的EDL，沿元跗骨远端肌腱的。提起TA肌肉的方式，小心不要划伤或触摸EDL下。返回到远端肌腱的EDL，剪断每一个和吸引他们的脚踝，然后抓筋，轻轻将EDL远离其余的肢体。它应该释放从近端自由，但如果没有，返回的横向切口，以确保被切断肌腱。取下的肌肉和地方充满了冷冻含氧林格在解剖盘。引脚通过腱的肌肉，约休息的长度，这是在体内发现的长度。如果肌肉拉解剖销的长度太短时，肌肉是松弛的，在盘子里，又太长。
5. 安乐死鼠标紧随肌肉除去通过颈椎脱臼。
6. 配合缝合线的10笠头，尽可能接近的肌肉，但不触及肌肉。脚的肌肉使用的缝合线长度约休息。

2。膜片夹层和准备（约30分钟）

1. 安乐死此过程之前的小鼠麻醉下，通过颈椎脱臼，如果相同的鼠标进行两个解剖，或由CO _2，然后通过确认颈脱位。
2. 在皮肤上做一个切口，暴露在腹腔和胸腔。打开腹腔，切肋骨下方的体壁。使用骨剪刀，膜片插入，切断围绕整个肋笼的肋线后，切穿脊椎以上开始。切血管贯穿中心的隔膜，使得隔膜可以容易地除去。
3. 取出膜片鼠标，并在解剖菜充满含氧林格的地方。轻轻搅动DIAPhragm的菜洗血。刷新林格液的需要。
4. 切一小条从中心腱膜片沿横向横膈膜肌收缩之情形的中央部中的纤维取向的肋。之间应该是2-4毫米宽的条带。使用骨剪刀，切割肋任一侧上的条带，留下约1-2毫米悬膜片条任一侧上的肋。
5. 配合中央肌腱缝合。扎缝合的横向凸肋端，然后把这些一起做了一大圈。
6. 两个条带，可以得到从任何给定的膜片（每侧一个从）。

3。安装肌肉力学浴缸

1. 抓住缝线和使用这些附加的肌肉的一端上的刚性后，换能器的另一端上的力。
2. 调整长度，以确保肌肉不松弛，但不紧。一个很好的近似是休息MUSC乐长在1.4 - 1.5。
3. 浴应充满含氧林格液维持在22°C，延长肌肉的稳定性进行测试。肌肉应休息5分钟前在此沐浴功能测试，使肌肉温度平衡到22℃

4。等长收缩

1. 建立超强刺激条件。后肌肉被放置在洗澡时，使用单0.5毫秒刺激脉冲产生抽搐，监控力输出。力逐渐增加电流，直到达到最高，但稳定的水平。增加电流超过该水平的剩余的实验10％。
2. 建立最佳长度。使用等距抽搐刺激，逐渐调整长度的肌肉，直到获得一个最大的力。休息的肌肉每次收缩〜10秒之间。最佳肌肉长度（L _O）时，抽搐力是最大的。记录肌肉长度（长度之间的myotendinous路口EDL和之间的中心腱myotendinous结和肌肉插入肋），使用游标卡尺。
3. 最大等长强直力量。刺激肌肉设定为_L O一段500毫秒，0.5毫秒脉冲在一系列的超强刺激，在融合频率（频率力的关系（ 例如编号^：8）从高原的高原EDL肌肉是通常达到120赫兹和100赫兹的膈肌。刺激相应的频率在3次刺激一阵阵的每一块肌肉之间的休息时间为5分钟。

5。离心收缩

1. 允许休息5分钟之间进行等长收缩和离心收缩的肌肉。
2. 刺激肌肉等长，在80赫兹的最初的500毫秒，随后用_10％L O伸展在最后200毫秒刺激（以拉伸速度为0.5 _L O/秒）。
3. 重复刺激模式，用5分钟的休息之间的所需数量的离心收缩。
4. 测量每个拉伸前的时间段中的收缩力。计算之间的第一个和最后一个收缩力下降。

6。肌肉去除的设备

1. 缩短肌肉长度的传感器可以温和去除肌肉和发布，并返回它与林​​格解剖盘。
2. 肌肉删除缝线。
3. 对于肌肉的EDL，吸干肌肉两次，然后称量之前，后续加工（ 如冻结，定影等）。这将是很重要的，用于计算的横截面面积，和特定的力。
4. 对于膈肌，浸泡在0.1％普施安橙，膜浸透染料为15-20分钟。这将提供一个索引的剥离损伤。
5. 解剖的肌肉远离骨性插入的，以及占RAL肌腱。这是必要的，以提供精确的肌肉重量。吸干以上称重前及随后编写。
6. 计算截面积（CSA）：
   ^CSA（2毫米）=质量（mg）/ _[（L O毫米）*（L _/ L o）*（1.06毫克/毫米^3）
   其中L / _Lo是纤维肌肉长度比（0.45 EDL，1.0为隔膜^）5和1.06是肌肉的密度。

结果

图1中所示的预期值从12周龄的动物的EDL肌肉的等长收缩力。因为MDX肌肉表现出代偿性肥大，总强直收缩力可以在mdx肌肉相比，年龄匹配的野生型控制。但是，更合适的功能输出的措施是特定的力（ 图2），其中，力被归为横截面面积来计算这个值。具体的力依赖于固有的肌肉功能的能力，在营养不良的肌肉更明显的弱点时，绝对力量和横截面面积占。在我们的手中，EDL mdx小鼠肌肉产生约20 - 25％的力量比那些匹配的年龄从10 - 26周龄的野生型小鼠。

对于隔膜，只有特定的力为相关的比较，因为该制剂是一块肌肉取决于的DISSEction。比较野生型和MDX膈肌之间的比力反映在这个组织病理学的进步。等长收缩力输出逐渐减少（ 图3）随着年龄的增长，因此，6个月的年龄，mdx小鼠的膈肌产生不超过一半的年龄相匹配的野生型控制功能输出的隔膜条。

离心收缩隔膜测试的一个例子如图4所示。随着每个后续的离心收缩，力量输出逐渐减少从野生型（C57）和mdx小鼠隔膜条。但是，该损失的力量就更加突出了在mdx小鼠的肌肉样本，大概是从抗肌萎缩蛋白及其相关蛋白的情况下。

在野生型的等距强直收缩力和mdx EDL肌肉f 图1。 ROM 12周大的老鼠。绝对的力量可以高于年龄匹配的MDX EDL肌肉代偿性肥大。

图2。肌肉横截面面积归等距强直收缩力比力，并揭示了郁闷EDL肌肉功能的能力mdx小鼠较野生型小鼠。轨迹是从图1中的相同的小鼠。

图3。力发电能力的逐渐丧失，比力评估是最明显的在隔膜（红柱）mdx小鼠相比，野生型（C57在蓝线）。

36/50036fig4.jpg“/>
图4。武力作为一个离心收缩功能的数量从12周龄C57和mdx小鼠的膈肌的损失。数据平均值±SEM为N = 4每基因型的肌肉。

讨论

这篇文章的目的是提供指导进行隔离两块肌肉的小鼠的肌肉功能 - EDL和隔膜。评估能够洞察这些肌肉或肌肉疾病的治疗候选人是否是有益的。对于这两种肌肉，强大的数据获取的主要因素是一个干净的清扫。因此，实践和完善的初步分离步骤是必不可少的，然后再移动到功能测试。此外，建立正常的肌肉功能的基准进行比较之前营养不良的肌肉，或在治疗的关键。这将确保研究结果的能力进行实验的人所给予的高度可变性不受。膜浸透染料的使用可以帮助优化解剖制剂，孵化任何肌肉的溶液中，含有这样的染料将马克受损最严重的纤维，并且可以作为一个索引d的issection成功。在肌肉纤维受损的数目最小化，将有助于优化测量。夹层损坏的纤维的荧光比偏心收缩损坏更明亮，因此，如果将染料的力学过程期间也使用，人们可以使用的染料的强度来区分两种类型的伤害。

膜片带剖析将几乎总是有纤维损伤，仅仅是因为通过沿着纤维的长度切割，一些不可避免地浏览销毁。在这些受损的纤维上染率是强大的，而这些通常是受限制的外边缘的准备。平均来说，我们观察到的损坏的纤维是〜3纤维的宽度（〜120微米）的任一侧上的肌肉带的频带。如果损坏的频带包括超过15％的肌肉，然后将数据将被丢弃。隔膜准备，也有约束的最佳大小，功能的措施。我们已经发现，件d的的iaphragm，超过5毫米宽开始自己折叠起来，，由于中央肌腱领带的是只在一个点上。这将导致比力下降的准备。我们还发现，窄条也有较低的比力，我们相信这是因为解剖过程中损坏的纤维包括总纤维数的比例较大。例如，如果0.1毫米每一侧上被破坏，然后是5％（2x0.1月/ 4毫米钢带）的肌肉制剂没有贡献给力，而如果带是只有1毫米，然后20 ％的肌肉制剂被损坏。因此，无论是损坏的区域的宽度，以及在整个制备过程中的宽度是重要的因素来控制。

最大等长收缩张力的测量要求所有在肌肉的肌纤维受到刺激。由于有巨大的功能装置的组件中的变化，这是必须为每个单独的组确定了。浴的尺寸或类型的激励器，例如，可以影响的刺激的强度。抽搐刺激是一个合理的方法来确定超强刺激条件。一旦这是建立一个特定的设置和肌肉，它可以被用于随后的研究。

与此相反，需要测量的最佳长度的任何给定的肌肉为每个准备使用如上所述的迭代过程。这将确保厚，细肌丝的重叠是最佳的，测量的最大潜在力发电能力。替代程序可以依靠与肌肉条纹相关的衍射图案，但是，这需要额外的设备，这里不作说明。

我们经常使用500毫秒刺激的持续时间，在这一领域的其他研究者使用此参数范围的中间，落在了。虽然这可能会导致一些疲劳的肌肉在收缩，这是显而易见的通过“下垂”的最大力量生产，这本身可以丰富。比如，在疲劳的差可以由不同类型的疗法包括那些目标钙处理，来实现，因此，在主动收缩力的凹陷可以作为一个指数为改善。另外，力的损失可能表明，筋缝合不够严密，并，他们滑倒在收缩。肌肉必须从浴中取出，并缝线必须重新绑如果发生这种情况。我们还使用了一系列的3强直收缩，这有助于稳定评估的准备。同样，缝合单将导致损失之间的收缩力，需要缝合重新捆绑。大肌肉也可能会产生缺氧的核心，从而导致力损失的协议。肌肉的大小是一个限制因素进行孤立的肌肉功能测试，EDL质量大于20 mg的肌肉失去力量，每个合同TION，并不能支持灌流的浴中。隔膜条不遭受相同的并发症，因为他们很瘦，足有长期在洗澡的可行性。

可以用于其他肌肉孤立的肌肉功能，包括比目鱼肌，这是常用的，但这里不作说明。可以采用许多相同的程序的比目鱼的编制及功能测试。然而，主要的差别是在刺激频率，离心收缩的参数。为函数的比目鱼肌补充使用，其他两个的肌肉，因此它应被看作是一个“标准的包”用于评估营养不良的小鼠^4，7的一部分。

离心收缩提供了一个收缩的脆弱性指数，重要的是要使用的协议，结果在温和的野生动物的肌肉力量损失和重大损失的力未处理的营养不良的肌肉，使有一个宽的动态​​范围进行比较。任何力量缺乏的损失在正常肌肉离心收缩是太温和了，没有足够的区分是没有有效的治疗方法，和那些真正有利的。然而，在正常肌肉离心收缩力大幅下降，可能是太伟大了，梳理出与疾病相关的差异。我们的协议EDL和隔膜采用了0.5桢/秒的拉伸率，产生10％的长度变化。我们通常执行5个离心收缩，从而导致正常肌肉的力量和显着的损失在营养不良的肌肉力量小的损失。当然，所有这些参数可以改变，以增加整体的长度的变化，拉伸率，或离心收缩的数量，以便区分患病和健康的肌肉之间的差异，以及对一个特定类型的突变的影响或t正在研究reatment 1。只要有一个明显的区别正常和病变的肌肉，然后有一个金标准，在治疗方面达到。

总之，此协议规定执行等长收缩和离心收缩的指导方针，并希望确定潜在的隐患时要避免设置此技术在实验室中。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂/材料名称	公司	目录编号	评论
在体外肌肉测试系统	极光科学	1200A
解剖显微镜	徕卡	MZ6
ACE光源	肖特-Fostec	A20500
解剖剪	精细科学工具	14060-11
角度的解剖剪刀	精细科学工具	15006-09
手术刀手柄	精细科学工具	10003-12	备用解剖工具
弯曲的手术刀片＃12	美术学工具	10012-00	备用解剖工具
骨性剪刀	精细科学工具	16044-10
S＆T缝合线栓钳	精细科学工具	00272-13
杜蒙角度的不锈钢镊子 -	精细科学工具	11203-25
编织丝线缝合大小6-0	泰利福医疗	07-30-10
医用胶带	Transpore	3M
氯胺酮盐酸盐100毫克/毫升	Hospira公司	NDC 0409-2051-05	最终剂量为80毫克/公斤
TranquiVed注射液（甲苯噻嗪的100毫克/毫升）	Vedco	NDC 50989-234-11	最终剂量是10毫克/千克
活性橙14	Sigma-Aldrich公司	R-8254
林格液组件			解决方案是用95％O 2和5％CO 2，最终的pH值7.4平衡气体
氯化钠	Sigma-Aldrich公司	S7653	终浓度为118毫米
氯化钾	Fisher Scientific则	P217-3	终浓度为4.7毫米
二水氯化钙	Fisher Scientific则	C79-500	终浓度为2.5毫米
磷酸二氢钾	Fisher Scientific则	P-285	终浓度为1.2毫米
硫酸镁	JT贝克	2500-01	终浓度为0.57毫米
4 - （2 - 羟乙基）管razine-1-乙磺酸（HEPES）	Fisher Scientific则	BP310-500	终浓度：5.95克/升
葡萄糖	Sigma-Aldrich公司	G8270	终浓度为5.5毫米