筋ジストロフィーのマウスモデルから分離された骨格筋の等尺性と偏心力発生アセスメント

要約

筋機能の測定は、筋肉病理のための潜在的な治療法の評価と同様に、この組織の生理機能のメカニズムの決定に貢献しています。我々は、機能テストのための長趾伸筋と横隔膜の筋肉の準備のデモンストレーションを行います。アイソメトリックとエキセントリック収縮のためのプロトコルは、病理学的状態を表すジストロフィー筋の間で結果の違い、および野生型の筋肉だけでなく、表示されます。

要約

筋肉の病気のための潜在的な治療法の評価に重要な筋機能の高感度で再現性の生理学的な評価です。多くの前臨床試験では、これらの疾患のマウスモデルに依存しているため、隔離された筋肉の機能は、患者にまで前方に新薬候補を移動する]の[移動/ NOGO意思決定のための基準の一つとなっている。私たちは、これらの研究のために利用優勢な筋肉である機能テスト用の長趾伸筋（EDL）と横隔膜の筋肉の準備のデモンストレーションを行います。 EDL筋肉のジオメトリは2簡単にアクセス腱、浴中の灌流によってサポートすることができる小型で、隔離された筋肉の準備に最適です。ダイヤフラムは、筋ジストロフィーの動物で深遠な進歩的な病態を示し、線維症に対抗する多くの潜在的な治療法を評価し、筋線維の安定を促進するためのプラットフォームとして機能することができます。アイソメトリックとeccenを含め、定期的なテストのためのプロトコル、TRIC収縮は、表示されます。アイソメトリック力が強さの評価を提供し、エキセントリック収縮は、筋ジストロフィーの多くの種類で破壊されている鞘の安定性を評価するのに役立ちます。野生型およびジストロフィー筋肉から筋肉の間に期待される結果の比較も提供されます。これらの措置は、組織の恒常性の形態学的および生化学的測定と同様に、筋機能の全体の動物アセスメントを補完することができます。

概要

筋機能の測定は、筋肉病理のための治療の可能性の評価にだけでなく、この組織の生理機能のメカニズムの決定に貢献しています。筋疾患は、マウスモデルを使用することは、潜在的な治療薬の設計とテストにその知識を拡張するための遺伝子型と表現型の間のリンクを理解するための中心的なコンポーネントとなっています。筋ジストロフィーは、特に、これらのエージェントを評価し、患者での臨床試験に進めるために必要な前臨床データを確立するためにマウスに頼ってきた。頻繁なアウトカム指標は、研究の広い範囲に適用される強さを決定するために、隔離された筋肉の機能を使用しています。もう一つの指標は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを欠損している筋膜の完全性、およびこの疾患のマウスモデル（MDX）の変化を決定するために、偏心、または長く収縮の使用です。したがって、それはmeasuremこれらのタイプのために不可欠である親は高感度で再現性のあることが。

マウス長趾伸筋（EDL）筋肉が均一な繊維配向と決定的腱^{2、5、6、10、12を}含む、理想的なジオメトリやサイズに起因する絶縁型筋機能のために広く使用されてきました。 EDL筋肉アイソメトリック機能測定のための方法は、以前のJove出版物⁸のと同様に、TREAT-NMDのSOPの¹に記載されている。我々は、等尺性とエキセントリック収縮の両方が含まれるように、これらのメソッドの説明を拡張しました。病気の特徴は、変性/再生および減少力出力のheightedサイクルを含む、EDLに明らかである。

マウスの横隔膜は、マウス¹¹の他の筋肉に比べて筋ジストロフィーの中で最も急速な病理の進行を示す。生後6ヶ月までに、累積線維症は、筋肉の約50％を構成している。大幅impaireこの結果、D力出力^11。したがって、線維浸入を防ぐことができる治療薬は、横隔膜で効率的に評価することができます。

筋肉中のジストロフィンの損失が増加した脆弱性とすべての筋肉⁹の高まり収縮損傷につながる。したがってデュシェンヌ型筋ジストロフィーのための多くの治療法はジストロフィンの交換のために連動されています。このように、これらの戦略を評価するために不可欠となっている検定は、同様に収縮ダメージ^2、3、4からジストロフィー筋を保護するために特定の戦略を持っているメリットは何かを判断として、正常およびジストロフィー筋を区別することができ伸張性収縮^、、です^12。この手順では、/レコード長と力、力変換器から急速に別々の長さを調整する方法を調節することができるどちらのデュアルモードサーボモータを必要とします。

プロトコル

すべての手順は、ペンシルベニア大学の動物実験委員会によって審査され、承認されています。

1。 EDLの解剖と準備（約30分）

1. 彼らは処置中は痛みや苦痛を経験しないことを保証するためにマウスを麻酔しますが、筋肉が十分に循環させることによって酸素化のままにしておくこと。我々は日常的にIPを介して注入されたケタミン/キシラジンカクテル（100/10 mg / kg）を使用しています。麻酔の手術面は完全ペダルやpalpedral撤退反射の欠如、または耳の攣縮反応の欠如によって決定されます。
2. 医療用テープを使用して、後肢を固定し、この領域の筋肉を露出させるために下顎後肢の皮膚を取り除きます。一定の間隔で、PBSのアプリケーションと筋肉の潤いを保つ。
3. 解剖スコープ]で、EDL筋の近位腱を露出させるために、膝に横に小さな切開を行います。そこに、この領域内の2つの腱があり、両方を再有効にするためにカットする必要がありますEDLのmoval。
4. 内側の足首に、 メタtarsalsに沿って延びているEDLの遠位腱を露出させ、TAの筋肉の腱を切った。 EDLの下をカットしたり、触れないように注意しながら、道のTAの筋肉を持ち上げます。 、EDLの遠位腱に戻るスニップ各1、その後腱を把握し、足首を介してそれらを描き、そっと手足の残りの部分から離れてEDLを引き出します。それは自由に近位端から離し、そうでない場合、腱が切断されたことを確認するために横切開に戻るべきである。チルド酸素リンガーでいっぱい解剖皿に筋肉や場所を削除します。 生体内で見つかった長さである約休憩長で腱、筋肉をピン。長さは、筋肉が筋肉は解剖ピンを引っ張っている場合皿に弛緩し、長すぎる場合には短すぎる。
5. 頸椎脱臼による筋除去直後にマウスを安楽死させる。
6. 10に縫合糸を結ぶドンズ、できるだけ近くの筋肉にしますが、筋肉に触れていない。約縫合糸を使用して長さを休んで筋肉をピン。

2。ダイヤフラム解剖と準備（約30分）

1. 同じマウスを頸椎脱臼で確認続く解剖、あるいはCO ₂の両方を受けた場合には、麻酔下頚椎脱臼により前に、この手順にマウスを安楽死させる。
2. 腹部や胸部空洞を公開するために皮膚切開を加えます。腹腔を開き、ちょうど肋骨下の体壁を切った。骨のはさみを使用して、ダイヤフラムの上に挿入開始、リブのラインに続く胸郭全体の周りにカットし、背骨を切って。ダイアフラムが容易に除去することができるように横隔膜の中心を通る血管を切った。
3. マウスからダイアフラムを外し、酸素リンガーズでいっぱい解剖皿に置きます。優しくdiapを扇動血を洗い流すための皿の中でhragm。必要に応じてリフレッシュ液をリンゲル。
4. 横hemidiaphragmsの中央部における繊維の配向に沿って腱中心から肋骨横隔膜の小さなストリップをカット。ストリップは広い2〜4ミリメートルの間でなければなりません。骨のはさみを使用して、ダイヤフラムストリップの両側にリブの約1〜2 mmのオーバーハングを残して、ストリップの両側にリブをカット。
5. 腱中心に縫合糸を結ぶ。横方向に突き出たリブ側にそれぞれ縫合糸を結び、その後の大きなループを作るために一緒にこれらを結ぶ。
6. 二つのストリップは、任意のダイヤフラム（各側から1）から取得することができます。

3。力学バースの取り付け筋肉

1. 縫合糸をつかみ、一方の端部に剛性のポストに筋肉を付けるために、これらを使用し、もう一方の端に力変換器に。
2. 筋肉がたるんではありませんが、ピンと張っていないことを確認するために長さを調整します。良い近似が休憩MUSCです1.4のように、leの長さ - 1.5。
3. 浴°Cはテストのために筋肉の安定性を延ばすために22で維持酸素化リンゲル液で満たされるべきである。その筋肉の温度が22℃に戻したので、筋肉が前に機能テストにこの浴中で5分間休むべき

4。等尺性収縮

1. 最大上刺激条件を確立します。筋肉が風呂に配置された後、けいれんを生成するために、単一の0.5ミリ秒の刺激パルスを使用し、力の出力を監視します。力が最大ではあるが着実なレベルになるまで徐々に電流を増加させる。残りの実験のために、このレベルより10％以上の電流は増加します。
2. 最適な長さを確立します。最大の力が得られるまでアイソメトリック筋の刺激を用いて、徐々に筋肉の長さを調整します。各収縮の間に筋肉〜10秒を休ませてください。収縮力が最大になるときに最適な筋肉の長さ（L _o）が達成されます。レコード筋肉の長さ（長さノギスを使用して、EDLのため、リブの中心腱myotendinousジャンクショ​​ンと筋肉の間に挿入myotendinous接合）トゥイーン。
3. 最大等尺性強縮フォース。最大上刺激で0.5ミリ秒のパルスのシリーズとと融合周波数（周波数、力関係（ 例えば Refの高原からで、500ミリ秒の期間L _Oに設定した筋肉を刺激する^：8）EDL筋肉のプラトーがある典型的には120 Hzの、100 Hzの横隔膜の筋肉のために達成しました。あらゆる筋肉の刺激の試合の間に5分の休憩時間に、それぞれの周波数で3回を刺激する。

5。エキセントリック収縮

1. 筋肉はアイソメトリックとエキセントリック収縮を実行する間に5分を休ませることができます。
2. 最後の200ミリ秒の刺激で10％L _{Oストレッチ} （0.5L _oの伸び率が続く最初の500ミリ、等尺用80 Hzで筋肉を刺激/秒）。
3. エキセントリック収縮の必要な数の間に5分休符と刺激パターンを繰り返します。
4. ストレッチの前に期間中の各収縮力を測定する。最初と最後の間の収縮力の低下を計算します。

6。装置からの筋肉の取り外し

1. トランスデューサからの筋肉の穏やかな除去を可能にし、投稿し、リンガーと解剖皿にそれを戻すために、筋肉の長さを短くしてください。
2. 筋肉から縫合糸を外します。
3. EDLの筋肉は、筋肉を二回ブロット、その後の処理（ 例えば凍結、固定など）の前に、それを重量を量る。これは、断面積、および特定の力を計算するために重要となるであろう。
4. 横隔膜筋の場合、0.1％プロシオンオレンジ、15〜20分間、膜透過性の染料に浸します。これは解剖損傷の指標を提供します。
5. 離れて骨の挿入から筋肉だけでなく、セントを解剖するRAL腱。これは、筋肉の正確な重量を提供することが必要である。体重とその後の準備の前に上記のように吸い取る。
6. 断面積（CSA）をクロス計算します。
   ^{CSA（㎜2）=}質量（mg）/ [（L _Oミリメートル）*（L / _{L○）*（1.06}ミリグラム/ mm ^3の ）]
   ここで、L / _L、Oは、筋肉の長さの比（EDL、ダイヤフラムの1.0の^0.45）5〜繊維であり、1.06は、筋肉の密度である。

結果

12週齢の動物からEDL筋群の等尺性力に対する期待値を図1に示します。 mdxの筋肉が代償性肥大を呈するため、トータルテタヌス力は年齢一致野生型対照と比較して、MDX筋肉で高くなることがあります。しかし、機能の出力のより適切な尺度は、力は、この値を計算するために断面積のために正規化されている特定の力（ 図2）です。具体的な力は絶対的な力と断面積の両方が考慮されている場合ジストロフィー筋肉の弱さがより明らかである筋肉の本来の機能的な能力に依存します。我々の手で、mdxマウスからEDL筋肉は約20を生成する - 26週齢 - 10から野生型マウスにマッチした時代のものよりも25％低い特定の力を。

準備がdisse依存筋肉の一部であるため、ダイアフラムのは、特定の力は比較のために関連していますction。野生型およびMDX横隔膜の筋肉の間に特定の力の比較では、この組織における進行性の病態を反映している。アイソメトリック力出力は、生後6ヶ月で、mdxマウスから横隔膜の筋肉が年齢をマッチさせた野生型コントロールからダイアフラムストリップの機能出力の半分以上のものを出さないように、（ 図3）加齢とともに減少します。

ダイアフラムテストから偏心収縮の例を図4に示す。後続の各伸張性収縮では、力の出力は、野生型（C57）とmdxマウスの両方からダイアフラムストリップに減少します。しかし、力のロスがあると推測されるジストロフィンとその関連タンパク質の不在から、mdxマウスの筋サンプルでより劇的です。

図1野生型とMDXのEDL筋肉fのアイソメトリックテタヌス力 ROM 12週齢のマウス。絶対的な力は、代償性肥大のために年齢をマッチさせたMDX EDL筋肉に高くなることがあります。

筋肉の断面積で正規化した図2。アイソメトリックテタヌス力は特定の力であり、野生型マウスに比べmdxマウスからEDL筋肉の落ち込んで機能的能力を明らかにする。トレースは図1と同じマウスからです。

図3：特定の力によって評価力発電能力の漸進的な損失は、野生型（青線でC57）に比べて（赤いバー）mdxマウスの横隔膜の中で最も明白である。

36/50036fig4.jpg "/>
図4：12週齢C57とmdxマウスから横隔膜の筋肉のための伸張性収縮数の関数としての力の損失。データは平均値である±遺伝子型ごとにN = 4の筋肉のためのSEMである。

ディスカッション

EDL及びダイアフラム - この記事の目的は、マウスから2筋に孤立筋肉の機能を実行するための指針を提供することである。これらの筋肉の評価は、筋肉疾患の治療薬候補が有益であるか否かについての洞察を提供することができます。両方の筋肉のために、堅牢なデータを得るための重要な要因は、クリーン解剖です。したがって、初期分離ステップを練習し、完成すると、機能テストに移る前に、必要不可欠である。また、通常の筋肉のために機能的なベンチマークを確立することはジストロフィー筋へ、または治療間の比較を行う前に重要です。これは研究結果は、実験を行う人の能力によって与えられる高い変動の対象にはなりませんことが保証されます。膜透過性色素の使用は、染料を含む溶液中で、任意の筋肉のインキュベーションは、ほとんど損傷を受けた繊維をマークしますが、dの指標として役立つことができるため、解剖の準備を最適化することを支援することができますissection成功。筋肉で損傷繊維の数を最小限に抑えることにより、測定を最適化するのに役立ちます。解剖によって損傷繊維が伸張性収縮によって損傷したものよりもはるかに明るく蛍光を発すると、染料はまた力学プロセスの間に使用されていたら、人はダメージの2つのタイプを区別するために、色素の強度を使用することができます。

ダイアフラムストリップの解離はほぼ必ず、繊維の長さ方向に沿って切断することにより、いくつかは必然的に破壊さという理由だけで、繊維の損傷を持つことになります。色素の取り込みは、これらの破損した繊維で強力であり、これらは通常、準備の外縁に制限されています。平均的に、我々は、筋条片の両側に幅約3繊維（〜120μm）であり、破損した繊維のバンドを観察します。損傷したバンドは筋肉の15％以上を含む場合、そのデータは破棄されます。横隔膜標本は、機能の対策の最適なサイズ上の制約があります。我々は、dの部分ことを発見した腱中心のタイは一点のみであるため、5ミリメートルより広いiaphragmは、自分自身に畳むし始める。この結果は、準備のために特定の力を減少させた。我々はまた、狭いストリップはまた、我々は解剖中に破損した繊維の数字は総繊維数の大きな割合を含んでいるためであると考えて下の特定の力を持っていることを発見した。例えば、それぞれの側に0.1ミリメートルが破損している場合、それは、強制的に寄与しない筋標本の5％（2x0.1ミリメートル/ 4ミリメートルストリップ）であるのに対し、ストリップはその後わずか1mm、20の場合筋標本の％が損傷しています。したがって、損傷領域の幅だけでなく、製剤全体の幅の両方を制御するための重要な要因である。

最大等尺性張力の測定は、筋肉内のすべての筋線維が刺激されている必要があります。機能装置の部品の大幅な変動があるので、これは個々のセットのために決定されなければならないアップ。たとえば、お風呂の大きさや刺激の種類は刺激の強度に影響を与えることができる。単収縮刺激は最大上刺激条件を決定するために合理的な方法です。これは特定のセットアップや筋肉のために確立されると、それは、その後の研究のために利用することができる。

これとは対照的に、任意の筋肉の最適な長さは、上記の反復プロセスを使用して、各調製のために測定する必要があります。このことは、厚いと薄いフィラメントの重なりが最適であると発電容量を最大の潜在的な力が測定されることを保証します。代替手順は、筋肉の横紋に関連付けられた回折パターンに依存することができますが、これはここで説明されていない追加の機器が必要です。

我々は日常的にこの分野における他の研究者によって使用され、このパラメータの真ん中範囲内500ミリ秒の刺激の持続時間を使用します。これは明らかである収縮、筋肉の中にいくつかの疲労を引き起こすかもしれませんが最大の力生産の "ダレ"で、これ自体は有益なことができます。例えば、疲労の差が故にアクティブ収縮時の力のたるみは改善のための指標となることができ、その目標カルシウム処理も含めて治療法の異なる種類によって達成することができる。あるいは、力の損失は腱に縫合糸は十分なタイトではないことを示している、と彼らは収縮時に滑っていることでした。筋肉を浴から除去されなければならない、これが発生した場合の縫合糸は、再接続する必要があります。我々はまた、製剤の安定性を評価するのに役立ち3テタヌス収縮のシリーズを使用しています。繰り返しになりますが、縫合スリップは再抱き合わせ縫合を必要と収縮との間の力の喪失につながる。大きな筋肉は、プロトコルの間の力の損失につながる無酸素コアを生成することができる。筋肉のサイズが20より大きい質量を持つEDL筋肉がミリグラム各contracと力を失い孤立した筋機能テストを実行するための制限要因であるると、浴中の灌流でサポートすることはできません。彼らは風呂で長時間生存能力を持つのに十分薄いためダイヤフラムストリップは同じ合併症で苦しむことはない。

他の筋肉は一般的に使用されるが、ここで説明されていないヒラメ筋など、孤立した筋機能のために利用することができます。同じ手順の多くは、準備と機能テストの面でヒラメを採用することができる。しかし、主な相違点は、刺激周波数にあり、エキセントリック収縮のためのパラメータ。関数のヒラメを使用する他の二つの筋肉のことは、補完するものであり、従ってそれはジストロフィーマウス^4,7を評価^するための"標準パッケージ"の一部として考慮されるべきである。

エキセントリック収縮は、収縮もろさの指標を提供します、そして、それは野生動物からの筋肉の力のささやかな損失との力の大幅な損失をもたらしているプロトコルを使用することが重要です。比較のため、広いダイナミックレンジがあるように未処理ジストロフィー筋。通常の筋肉内の任意の力の損失の欠如は、伸張性収縮があまりにもマイルドであることを示唆し、かつ効果的な治療法はありませんし、真に有益なものを区別するのに十分ではありません。しかし、伸張性収縮を受け、通常の筋肉の力の劇的な損失は、疾患に関連する差異を引き出すには余りにも大きいかもしれません。 EDLとダイヤフラムのための私たちのプロトコルには10％の長さの変化を生成する0.5ロー/秒の伸び率を使用しています。我々は、典型的には5エキセントリック収縮は、正常な筋肉の力の小さい損失およびジストロフィー筋肉の力の大幅な損失に結果を実行します。確かに、これらのパラメータのすべてが病気の、健康的な筋肉の間に、同様の変異の特定のタイプの効果の違いを区別するために、全体の長さ変化、ストレッチのレート、またはエキセントリック収縮の数を増やすために変化させることができるまたはtreatment 1は勉強しています。限り正常と疾患筋肉の間に顕著な違いがあるように、その後の治療の観点からのために達するために、金本位制があります。

要約すると、このプロトコルでは、等尺性とエキセントリック収縮を実行するためのガイドラインを確立し、うまくいけば、あなたのラボでこのテクニックをセットアップするときに回避するために潜在的な落とし穴を識別します。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬/材料の名称	会社	カタログ番号	注釈
in vitroでの筋力テスト·システムの	オーロラ·サイエンティフィック	1200A
解剖顕微鏡	ライカ	MZ6
ACEの光源	SCHOTT-Fostec	A20500
解剖用はさみ	ファイン科学ツール	14060から11
アングルド解剖ハサミ	ファイン科学ツール	15006から09
スカルペルハンドル	ファイン科学ツール	10003から12	代替解剖ツール
湾曲したメス刃＃12	ファインサイエンスツール	10012から00	代替解剖ツール
骨はさみ	ファイン科学ツール	16044から10
S＆Tの縫合抱き合わせ鉗子	ファイン科学ツール	00272から13
デュモンSS鉗子 - 角度付き	ファイン科学ツール	11203から25
編んだ絹縫合サイズ6から0	テレフレックスメディカル	07-30-10
医療テープ	Transpore	スリーエム
塩酸ケタミン100 mg / mlの	ホスピーラ	NDC 0409-2051-05	最終用量は80 mg / kgである
TranquiVedインジェクション（キシラジン100 mg / ml）を	Vedco	NDC 50989-234-11	最終用量は10 mg / kgである
リアクティブオレンジ14	シグマアルドリッチ	R-8254
ソリューションコンポーネントをリンゲル			解決策は、95％O 2および5％CO 2、最終pH 7.4で平衡化ガスである
塩化ナトリウム	シグマアルドリッチ	S7653	最終濃度：118ミリメートル
塩化カリウム	フィッシャー·サイエンティフィック	P217-3	最終濃度：4.7 mMの
塩化カルシウム二水和物	フィッシャー·サイエンティフィック	C79-500	最終濃度：2.5mMの
リン酸二水素カリウム	フィッシャー·サイエンティフィック	P-285	最終濃度：1.2mMの
硫酸マグネシウム	JTベーカー	2500から01	最終濃度：0.57 mMの
4 - （2 - ヒドロキシエチル）パイプrazine-1-エタンスルホン酸（HEPES）	フィッシャー·サイエンティフィック	BP310-500	最終濃度：5.95 g ​​/ Lの
グルコース	シグマアルドリッチ	G8270	最終濃度：5.5 mMの